Questions fréquentes — Charlie Bioinformatique

Charlie travaille à partir d'une matrice d'expression : un tableau où les gènes figurent en lignes et vos échantillons en colonnes. Deux grandes familles de données sont prises en charge de bout en bout — les puces à ADN (microarray), dont les valeurs sont déjà en échelle logarithmique, et le RNA-seq déjà normalisé (en CPM, TPM ou FPKM).

Vous pouvez également charger des comptages bruts de RNA-seq. Charlie les accepte et les prépare correctement pour l'exploration (analyse en composantes principales, cartes de chaleur, regroupements). En revanche, l'analyse différentielle sur des comptages bruts reste exploratoire : la méthode statistique de référence pour ce cas — un modèle binomial négatif, comme DESeq2 — est en cours de développement. Charlie vous le signale avant de lancer l'analyse.

Le tableau ci-dessous se lit ligne par ligne : le type de fichier que vous avez sous la main, l'échelle de ses valeurs, le traitement que Charlie lui applique automatiquement, et les analyses qui vous sont alors ouvertes.

Toutes ces données mesurent la même chose — l'expression des gènes, c'est-à-dire l'ARN. Microarray et RNA-seq ne diffèrent que par la façon de la mesurer. La mention « déjà normalisé » renvoie à la correction de la profondeur de séquençage, propre au RNA-seq : un échantillon davantage séquencé donne des valeurs plus élevées partout sans qu'aucun gène ne soit réellement plus exprimé, et CPM, TPM ou FPKM corrigent ce biais purement technique. Un microarray ne séquençant pas, cette notion ne le concerne pas.

Un mot enfin sur le terme « brut », qui recouvre deux réalités très différentes. Des comptages bruts sont déjà un tableau de gènes et d'échantillons, simplement pas encore corrigé de la profondeur de séquençage : Charlie les accepte. Les fichiers de séquençage (FASTQ) sont tout autre chose — les lectures qui sortent du séquenceur, bien en amont du moindre tableau. Charlie ne les traite pas : il part toujours d'une matrice d'expression déjà constituée.

Vous pouvez travailler à partir de vos propres fichiers ou d'un jeu de données public. Dans le premier cas, vous importez un tableau depuis votre poste, aux formats Excel, CSV ou TSV. Dans le second, il suffit d'indiquer un identifiant GEO (de la forme GSE…) : Charlie récupère alors le jeu de données directement depuis la base publique NCBI GEO, sans que vous ayez à le télécharger vous-même.

Chaque projet affiche en tête son origine et ses caractéristiques principales — le titre de l'étude, le nombre d'échantillons et de gènes, l'échelle détectée, et, pour un jeu GEO, ses identifiants d'accession et de plateforme. Un jeu de données déjà importé peut par ailleurs être réutilisé pour un nouveau projet, sans le réimporter.

Charlie organise le travail en cinq onglets, qui suivent l'ordre naturel d'une analyse.

Tout part de l'onglet Données, où vous préparez votre jeu : Charlie y reconnaît vos gènes, contrôle l'échelle des mesures, vous laisse définir vos groupes de comparaison et parcourir un aperçu de vos variables. Vient ensuite Analyses, où vous construisez vos représentations — composantes principales, cartes de chaleur, volcano — sous forme d'étapes que vous enchaînez au fil de votre investigation. Les gènes qui retiennent votre attention, vous les réunissez dans le Panier. À partir de ce panier, l'onglet Enrichissement dégage les fonctions et voies biologiques sur-représentées. Enfin, la Bibliographie, à venir, reliera vos gènes à la littérature scientifique.

L'onglet Données réunit tout ce qui prépare et décrit votre jeu avant l'analyse, en trois volets.

Le premier, Préparation des données, en est le cœur. Charlie y reconnaît vos gènes (voir la question suivante), puis vous permet d'écarter les identifiants qu'il n'a pas pu annoter et les colonnes qui ne sont pas des gènes, de filtrer les valeurs manquantes, et — si le contrôle qualité le suggère — de normaliser les échantillons pour les rendre comparables. À chaque fois, Charlie propose une recommandation, mais la décision vous revient.

Le deuxième volet vous laisse créer vos propres groupes d'échantillons à partir de vos variables (par traitement, par condition…), afin de préparer les comparaisons de l'onglet Analyses.

Le troisième, Aperçu des données, en donne une vue d'ensemble immédiate : un extrait de la matrice, un résumé des variables catégorielles détectées (traitement, source, etc.), et le classement des cinquante gènes les plus variables — un premier regard sur ce qui distingue vos échantillons, avant même d'avoir lancé une analyse.

Un fichier d'expression contient rarement des noms de gènes lisibles : le plus souvent, ce sont des numéros de sondes (par exemple ILMN_1802380) ou des identifiants de bases de données (Entrez, Ensembl). Les rapprocher un à un des noms de gènes est un travail long et propice aux erreurs, d'autant qu'il faut tenir compte des noms qui ont changé au fil du temps.

Charlie s'en charge automatiquement. À l'import, il reconnaît le type de vos identifiants, les traduit en noms de gènes, et met à jour ceux qui sont devenus obsolètes vers la nomenclature en vigueur. Vous récupérez ainsi un jeu de données prêt à analyser, dont les gènes portent leur nom courant — sans avoir écrit une ligne de code ni consulté de table de correspondance.

Surtout, le résultat vous est présenté sans ambiguïté. Le bandeau « Annotation » indique la part de gènes reconnus (par exemple « 8 763 sur 9 980 »), la provenance de l'annotation, et la liste des identifiants qui n'ont pas pu être rattachés — écartés des analyses plutôt que comptés à tort. Vous savez donc toujours ce que Charlie a reconnu et ce qu'il a laissé de côté.

Charlie annote automatiquement les gènes de neuf espèces couramment étudiées : l'humain, la souris, le rat, la drosophile, le poisson-zèbre, le ver C. elegans, la levure de boulanger, la plante modèle Arabidopsis et la bactérie E. coli. Pour y parvenir, il combine plusieurs sources d'annotation, dont la disponibilité dépend de l'espèce. Le tableau ci-dessous récapitule les moyens mobilisés pour chacune.

Pour ces neuf espèces, la traduction des identifiants s'appuie sur les bases d'annotation Bioconductor de référence (la colonne « Traduction »), gage de noms de gènes fiables. La mise à jour des noms obsolètes repose sur l'autorité de nomenclature propre à chaque espèce — HGNC pour l'humain, FlyBase pour la drosophile, et ainsi de suite. Elle n'est pas disponible pour la levure ni pour Arabidopsis, dont les bases ne fournissent pas de table de synonymes ; la perte est mineure, ces espèces ayant peu d'anciens noms en circulation. La reconnaissance directe des puces Illumina, enfin, ne concerne que l'humain, la souris et le rat, faute de puces équivalentes pour les autres espèces.

Si vous travaillez sur une espèce absente de cette liste, l'analyse reste possible : Charlie utilise l'annotation fournie par GEO lorsqu'elle existe, sinon vos identifiants sont conservés tels quels et vous pouvez fournir votre propre fichier de correspondance. Dans tous les cas, il vous indique clairement quand l'annotation automatique n'est pas disponible, plutôt que de vous laisser croire à un résultat.

Avant toute analyse, Charlie détecte l'échelle de vos valeurs : s'agit-il de comptages bruts, de données normalisées, ou de valeurs déjà en échelle logarithmique ? Cette détection détermine le traitement appliqué. Par exemple, pour une analyse en composantes principales, des comptages bruts sont d'abord normalisés puis passés en logarithme, afin que la profondeur de séquençage ne masque pas le signal biologique ; des données déjà logarithmiques, elles, sont laissées intactes pour éviter un double passage au log.

Tout ce que Charlie détecte et applique est affiché : l'échelle reconnue, la transformation utilisée, les gènes éventuellement écartés. Vous pouvez le vérifier et, si la détection automatique se trompe ou reste incertaine, corriger l'échelle vous-même.

Selon ce que Charlie détecte, voici ce qu'il prépare et ce que vous pouvez en faire :

Pour toute analyse différentielle, le résultat est un fold-change en log2, une correction pour tests multiples est appliquée (Benjamini-Hochberg par défaut), et des alertes signalent les groupes trop petits.

L'onglet Analyses couvre les représentations les plus courantes : contrôle qualité des échantillons, analyse en composantes principales et UMAP pour visualiser la structure des données, cartes de chaleur et corrélations, distributions, et expression différentielle (volcano et MA-plot). Pour en lancer une, vous ajoutez une étape et désignez, selon l'analyse, les groupes à comparer ou les paramètres voulus.

Vous pouvez procéder de deux façons. Soit vous construisez vos analyses vous-même, en choisissant chaque étape et ses réglages. Soit vous vous appuyez sur l'assistant Charlie, qui peut vous proposer une analyse à partir de vos critères et vous guider (voir plus bas). Dans les deux cas, c'est vous qui validez et lancez le calcul.

Chaque analyse se présente sous la forme d'une étape ajoutée à votre rapport, qui rassemble au même endroit tout le contexte du résultat. On y trouve le graphe lui-même, accompagné des informations qui le qualifient ; des paramètres d'ajustement que vous pouvez modifier, et dont l'effet se répercute parfois en direct sur la figure ; une légende explicative, générée à la demande, pour interpréter le résultat ; le détail du calcul, qui rappelle la méthode et les réglages appliqués ; d'éventuelles alertes de qualité ; et un aperçu des données qui ont servi à produire le graphe. Vous voyez ainsi non seulement le résultat, mais aussi comment il a été obtenu.

Ces étapes s'enchaînent librement : vous les accumulez pour mener votre investigation, d'une vue d'ensemble vers les gènes précis qui vous intéressent — que vous déposez alors dans le Panier.

Le volcano est l'analyse d'expression différentielle : il répond à la question « quels gènes s'expriment différemment entre mes deux groupes ? ». Chaque gène y est placé selon deux axes — l'ampleur du changement (le log2 fold-change, en horizontal) et la solidité statistique du résultat (la p-value corrigée, en vertical). Un gène n'est déclaré « significatif » que s'il franchit à la fois un seuil d'ampleur et un seuil de p-value : un fort changement peu fiable, ou un résultat fiable mais minuscule, ne suffit pas. Deux réglages, réunis dans les options avancées de l'analyse, gouvernent ce verdict.

Le test statistique s'adapte à la nature de vos données. Charlie retient par défaut le test t modéré (limma), la référence historique de l'analyse d'expression : plutôt que d'estimer la variabilité de chaque gène isolément — ce qui est très incertain quand les échantillons sont peu nombreux — il consolide cette estimation en s'appuyant sur l'ensemble des gènes du jeu. Le gain est net sur les petits groupes, la situation la plus fréquente. Le test de Welch, plus classique, reste proposé : sur des groupes fournis, les deux méthodes convergent vers le même résultat, si bien que le choix n'a alors quasiment aucune incidence.

Sur des comptages bruts de RNA-seq, aucun de ces deux tests n'est idéal : les méthodes de référence reposent sur un modèle conçu pour les comptages, comme DESeq2 ou edgeR, encore en développement. Charlie applique alors un t-test à titre d'approximation et vous prévient que le résultat est exploratoire.

La correction pour tests multiples, elle, est indispensable. Un volcano teste des milliers de gènes d'un seul coup ; sans correction, une partie d'entre eux ressortirait « significative » par le seul jeu du hasard. Charlie applique par défaut la correction de Benjamini-Hochberg, qui maîtrise le taux de fausses découvertes — le bon compromis pour une analyse à cette échelle. Les corrections de Bonferroni ou de Holm, également proposées, sont bien plus sévères : pensées pour écarter le moindre faux positif, elles deviennent trop conservatrices sur des milliers de gènes et risquent d'effacer un signal pourtant réel. Réservez-les à des cas particuliers.

C'est enfin la taille des groupes qui commande la puissance de l'analyse. Avec un seul échantillon par groupe, aucun test n'est possible ; avec deux à quatre, la puissance reste très limitée et les résultats ne valent qu'à titre indicatif ; ce n'est qu'avec des groupes plus fournis que les conclusions deviennent solides. Charlie signale ces situations directement là où vous configurez l'analyse, car de petits effectifs associés à des seuils stricts aboutissent souvent à « aucun gène significatif », même lorsqu'un signal faible existe réellement.

À côté de vos analyses, un assistant conversationnel connaît votre jeu de données et l'ensemble de vos résultats. Vous pouvez lui demander d'expliquer une étape, un choix ou une figure en langage clair, de commenter un résultat, ou de vous proposer une analyse correspondant à ce que vous cherchez — libre à vous de l'ajuster, de la valider et de la lancer. Comme il s'appuie sur vos données réelles et non sur des généralités, ses suggestions restent concrètes et adaptées à votre jeu. L'assistance s'enrichit progressivement : à ce jour, la définition des groupes de comparaison, par exemple, reste à votre main.

La fiabilité d'une analyse dépend d'abord de vos données et de vos choix ; Charlie ne s'y substitue pas, mais il signale ce qui mérite votre attention, directement là où vous configurez l'analyse. Il vous alerte notamment lorsqu'un groupe compte trop peu d'échantillons pour une comparaison solide, lorsque l'échelle des données est ambiguë, ou lorsqu'il s'agit de comptages bruts, pour lesquels l'analyse différentielle demeure exploratoire (la méthode dédiée, comme DESeq2, est en développement).

Le choix de la méthode statistique s'adapte par ailleurs à vos données — le test t modéré (limma) par défaut, le test de Welch si vous le préférez. Et si un point vous échappe, l'assistant peut vous expliquer une réserve ou vous suggérer un réglage plus prudent. L'objectif n'est pas de décider à votre place, mais de vous éviter de conclure sur une base fragile sans le savoir.

Au fil de vos analyses, vous repérez des gènes intéressants — les plus fortement différentiels, par exemple. Vous les rassemblez dans le Panier, qui devient votre liste de travail. L'onglet Enrichissement exploite ensuite cette liste pour répondre à une question de fond : ces gènes partagent-ils une fonction, une voie ou un processus biologique ? Charlie interroge les grandes bases de connaissances — Gene Ontology, KEGG, Reactome, entre autres — et met en évidence les termes significativement sur-représentés, afin de passer d'une simple liste de gènes à une interprétation biologique.

Charlie est conçu pour que vous puissiez juger par vous-même, plutôt que d'accorder une confiance aveugle. Trois principes le guident.

Le premier est la transparence : chaque décision prise sur vos données — l'échelle détectée, la transformation appliquée, les gènes écartés, les alertes de qualité — est affichée et modifiable. Rien ne se passe en silence.

Le deuxième est l'explication : l'assistant intégré peut vous expliquer en langage clair une étape, un choix ou un résultat, et attirer votre attention sur les pièges d'interprétation.

Le troisième est la validation sur données réelles : les méthodes de Charlie sont confrontées à des jeux de données publiés, dont la biologie est connue, afin de vérifier qu'elles retrouvent bien les signaux attendus (voir la question suivante).

Un point d'honnêteté, enfin : Charlie réduit le risque d'erreur silencieuse et signale ses limites, mais il ne remplace pas votre jugement scientifique. Pour une publication, la relecture par un expert reste recommandée.

Nous confrontons régulièrement Charlie à un ensemble de jeux de données publiés, dont la réponse biologique est connue d'avance, et nous vérifions qu'il retrouve les bons signaux — pas seulement que le calcul s'exécute. Deux études servent aujourd'hui de référence : l'une chez l'humain (cellules des voies respiratoires traitées à la dexaméthasone), l'autre chez la drosophile (invalidation du gène Pasilla).

Sur chacune, nous vérifions par exemple que les groupes attendus se séparent bien après préparation des données, que la profondeur de séquençage ne domine plus l'analyse, et que les gènes attendus ressortent dans le bon sens — comme CRISPLD2, induit par la dexaméthasone dans l'étude humaine, ou le gène Pasilla lui-même, réprimé dans l'étude où il a précisément été invalidé.

Deux précisions importantes. Cette validation porte sur un échantillon de jeux de référence (deux aujourd'hui, d'autres à venir), et non sur « tous les RNA-seq » : elle atteste la fiabilité de la méthode, pas la justesse d'une analyse particulière menée sur vos propres données. Par ailleurs, elle confirme que la biologie ressort correctement, mais ne vise pas l'égalité au chiffre près avec une méthode RNA-seq dédiée (DESeq2), encore en développement.