Veelgestelde vragen — Charlie Bio-informatica

Charlie werkt op basis van een expressiematrix: een tabel waarin de genen in rijen staan en uw monsters in kolommen. Twee grote gegevensfamilies worden van begin tot eind ondersteund — de DNA-chips (microarray), waarvan de waarden al op logaritmische schaal staan, en de reeds genormaliseerde RNA-seq (in CPM, TPM of FPKM).

U kunt ook ruwe tellingen van RNA-seq laden. Charlie accepteert ze en bereidt ze correct voor op de verkenning (hoofdcomponentenanalyse, warmtekaarten, clustering). De differentiële analyse op ruwe tellingen blijft daarentegen exploratief: de statistische referentiemethode voor dit geval — een negatief-binomiaal model, zoals DESeq2 — is in ontwikkeling. Charlie wijst u hierop voordat de analyse wordt gestart.

De onderstaande tabel leest u rij voor rij: het bestandstype dat u bij de hand hebt, de schaal van de waarden, de bewerking die Charlie er automatisch op toepast, en de analyses die u dan openstaan.

Al deze gegevens meten hetzelfde — de genexpressie, oftewel het RNA. Microarray en RNA-seq verschillen alleen in de manier waarop die wordt gemeten. De vermelding „reeds genormaliseerd” verwijst naar de correctie van de sequencingdiepte, eigen aan RNA-seq: een monster met een grotere sequencingdiepte geeft overal hogere waarden zonder dat enig gen werkelijk sterker tot expressie komt, en CPM, TPM of FPKM corrigeren deze zuiver technische vertekening. Omdat een microarray niet op sequencing berust, is dit begrip er niet op van toepassing.

Tot slot een woord over de term „ruw”, die twee heel verschillende werkelijkheden dekt. Ruwe tellingen vormen al een tabel van genen en monsters, alleen nog niet gecorrigeerd voor de sequencingdiepte: Charlie accepteert ze. De sequencingbestanden (FASTQ) zijn iets heel anders — de reads die uit de sequencer komen, ruim vóór ook maar enige tabel. Charlie verwerkt ze niet: het vertrekpunt is altijd een reeds samengestelde expressiematrix.

U kunt werken vanuit uw eigen bestanden of vanuit een openbare dataset. In het eerste geval importeert u een tabel vanaf uw computer, in de formaten Excel, CSV of TSV. In het tweede geval volstaat het een GEO-identifier op te geven (van de vorm GSE…): Charlie haalt de dataset dan rechtstreeks op uit de openbare database NCBI GEO, zonder dat u die zelf hoeft te downloaden.

Elk project toont bovenaan zijn herkomst en zijn belangrijkste kenmerken — de titel van de studie, het aantal monsters en genen, de gedetecteerde schaal en, voor een GEO-dataset, de accessie- en platformidentifiers. Een reeds geïmporteerde dataset kan bovendien worden hergebruikt voor een nieuw project, zonder die opnieuw te importeren.

Charlie organiseert het werk in vijf tabbladen, die de natuurlijke volgorde van een analyse volgen.

Alles begint bij het tabblad Gegevens, waar u uw dataset voorbereidt: Charlie herkent er uw genen, controleert de schaal van de metingen, laat u uw vergelijkingsgroepen definiëren en een overzicht van uw variabelen doorbladeren. Daarna komt Analyses, waar u uw weergaven opbouwt — hoofdcomponenten, warmtekaarten, volcano — in de vorm van stappen die u aaneenrijgt in de loop van uw onderzoek. De genen die uw aandacht trekken, verzamelt u in het Mandje. Vanuit dat mandje brengt het tabblad Verrijking de oververtegenwoordigde biologische functies en routes aan het licht. Ten slotte zal de Bibliografie, die eraan komt, uw genen verbinden met de wetenschappelijke literatuur.

Het tabblad Gegevens brengt alles samen wat uw dataset voorbereidt en beschrijft vóór de analyse, in drie onderdelen.

Het eerste, Gegevensvoorbereiding, vormt de kern. Charlie herkent er uw genen (zie de volgende vraag) en laat u vervolgens de identifiers die Charlie niet kon annoteren en de kolommen die geen genen zijn verwijderen, ontbrekende waarden filteren, en — als de kwaliteitscontrole dat suggereert — de monsters normaliseren om ze vergelijkbaar te maken. Telkens doet Charlie een aanbeveling, maar de beslissing is aan u.

Het tweede onderdeel laat u uw eigen monstergroepen aanmaken op basis van uw variabelen (per behandeling, per conditie…), om de vergelijkingen van het tabblad Analyses voor te bereiden.

Het derde, Gegevensoverzicht, geeft er een onmiddellijk totaalbeeld van: een uittreksel van de matrix, een samenvatting van de gedetecteerde categorische variabelen (behandeling, bron, enz.), en de rangschikking van de vijftig meest variabele genen — een eerste blik op wat uw monsters onderscheidt, nog voordat u een analyse hebt gestart.

Een expressiebestand bevat zelden leesbare gennamen: meestal zijn het probenummers (bijvoorbeeld ILMN_1802380) of identifiers uit databases (Entrez, Ensembl). Die één voor één koppelen aan gennamen is een langdurig en foutgevoelig werk, temeer omdat rekening moet worden gehouden met namen die in de loop van de tijd zijn veranderd.

Charlie neemt dit automatisch op zich. Bij het importeren herkent Charlie het type van uw identifiers, vertaalt ze naar gennamen en past verouderde namen aan de geldende nomenclatuur aan. Zo krijgt u een analyseklare dataset waarvan de genen hun gangbare naam dragen — zonder een regel code te hebben geschreven of een opzoektabel te hebben geraadpleegd.

Vooral wordt het resultaat u ondubbelzinnig gepresenteerd. De banner „Annotatie” geeft het aandeel herkende genen aan (bijvoorbeeld „8.763 van de 9.980”), de herkomst van de annotatie en de lijst met identifiers die niet konden worden gekoppeld — uit de analyses geweerd in plaats van ten onrechte meegeteld. U weet dus altijd wat Charlie heeft herkend en wat buiten beschouwing is gelaten.

Charlie annoteert automatisch de genen van negen veelbestudeerde soorten: de mens, de muis, de rat, de fruitvlieg, de zebravis, de worm C. elegans, de bakkersgist, de modelplant Arabidopsis en de bacterie E. coli. Om dit te bereiken combineert Charlie meerdere annotatiebronnen, waarvan de beschikbaarheid afhangt van de soort. De onderstaande tabel vat de ingezette middelen voor elke soort samen.

Voor deze negen soorten steunt de vertaling van de identifiers op de referentie-annotatiedatabases van Bioconductor (de kolom „Vertaling”), een garantie voor betrouwbare gennamen. Het bijwerken van de verouderde namen berust op de nomenclatuurautoriteit die eigen is aan elke soort — HGNC voor de mens, FlyBase voor de fruitvlieg, enzovoort. Dit is niet beschikbaar voor de gist noch voor Arabidopsis, waarvan de databases geen synoniementabel leveren; het verlies is gering, aangezien deze soorten weinig oude namen in omloop hebben. De rechtstreekse herkenning van de Illumina-chips, ten slotte, betreft alleen de mens, de muis en de rat, bij gebrek aan gelijkwaardige chips voor de andere soorten.

Als u met een soort werkt die niet in deze lijst staat, blijft de analyse mogelijk: Charlie gebruikt de door GEO geleverde annotatie wanneer die bestaat, anders worden uw identifiers behouden zoals ze zijn en kunt u uw eigen correspondentiebestand aanleveren. In alle gevallen geeft Charlie duidelijk aan wanneer de automatische annotatie niet beschikbaar is, in plaats van u een resultaat te laten vermoeden.

Vóór elke analyse detecteert Charlie de schaal van uw waarden: gaat het om ruwe tellingen, genormaliseerde gegevens, of waarden die al op logaritmische schaal staan? Deze detectie bepaalt de toegepaste bewerking. Voor een hoofdcomponentenanalyse worden ruwe tellingen bijvoorbeeld eerst genormaliseerd en dan logaritmisch omgezet, zodat de sequencingdiepte het biologische signaal niet maskeert; reeds logaritmische gegevens worden daarentegen ongemoeid gelaten om een dubbele log-omzetting te vermijden.

Alles wat Charlie detecteert en toepast, wordt weergegeven: de herkende schaal, de gebruikte transformatie, de eventueel geweerde genen. U kunt dit controleren en, als de automatische detectie zich vergist of onzeker blijft, de schaal zelf corrigeren.

Afhankelijk van wat Charlie detecteert, ziet u hier wat Charlie voorbereidt en wat u ermee kunt doen:

Voor elke differentiële analyse is het resultaat een fold-change in log2, wordt er een correctie voor meervoudig testen toegepast (Benjamini-Hochberg standaard), en signaleren waarschuwingen te kleine groepen.

Het tabblad Analyses dekt de meest gangbare weergaven: kwaliteitscontrole van de monsters, hoofdcomponentenanalyse en UMAP om de structuur van de gegevens te visualiseren, warmtekaarten en correlaties, verdelingen, en differentiële expressie (volcano en MA-plot). Om er een te starten, voegt u een stap toe en wijst u, afhankelijk van de analyse, de te vergelijken groepen of de gewenste parameters aan.

U kunt op twee manieren te werk gaan. Ofwel bouwt u uw analyses zelf op, door elke stap en de instellingen ervan te kiezen. Ofwel steunt u op de Charlie-assistent, die u een analyse kan voorstellen op basis van uw criteria en u kan begeleiden (zie verderop). In beide gevallen bent u het die valideert en de berekening start.

Elke analyse verschijnt in de vorm van een stap die aan uw rapport wordt toegevoegd en die op één plek alle context van het resultaat samenbrengt. U vindt er de grafiek zelf, vergezeld van de informatie die deze kwalificeert; afstelparameters die u kunt wijzigen en waarvan het effect zich soms live op de figuur laat zien; een verklarende legenda, op aanvraag gegenereerd, om het resultaat te interpreteren; het detail van de berekening, dat de toegepaste methode en instellingen in herinnering brengt; eventuele kwaliteitswaarschuwingen; en een overzicht van de gegevens die zijn gebruikt om de grafiek te produceren. Zo ziet u niet alleen het resultaat, maar ook hoe het is verkregen.

Deze stappen rijgen zich vrij aaneen: u stapelt ze op om uw onderzoek te voeren, van een totaalbeeld naar de specifieke genen die u interesseren — die u dan in het Mandje plaatst.

De volcano is de differentiële-expressieanalyse: hij beantwoordt de vraag „welke genen komen verschillend tot expressie tussen mijn twee groepen?”. Elk gen wordt erin geplaatst volgens twee assen — de omvang van de verandering (de log2 fold-change, horizontaal) en de statistische robuustheid van het resultaat (de gecorrigeerde p-value, verticaal). Een gen wordt pas „significant” verklaard als het tegelijk een omvangsdrempel en een p-value-drempel overschrijdt: een sterke maar weinig betrouwbare verandering, of een betrouwbaar maar minuscuul resultaat, volstaat niet. Twee instellingen, samengebracht in de geavanceerde opties van de analyse, bepalen dit oordeel.

De statistische test past zich aan de aard van uw gegevens aan. Charlie kiest standaard de gemodereerde t-test (limma), de historische referentie van de expressieanalyse: in plaats van de variabiliteit van elk gen afzonderlijk te schatten — wat zeer onzeker is wanneer er weinig monsters zijn — consolideert de test deze schatting door te steunen op het geheel van de genen in de dataset. De winst is duidelijk bij kleine groepen, de meest voorkomende situatie. De Welch-test, meer klassiek, blijft beschikbaar: bij ruime groepen convergeren beide methoden naar hetzelfde resultaat, zodat de keuze dan vrijwel geen invloed heeft.

Op ruwe tellingen van RNA-seq is geen van beide tests ideaal: de referentiemethoden berusten op een model dat ontworpen is voor tellingen, zoals DESeq2 of edgeR, die nog in ontwikkeling zijn. Charlie past dan een t-test toe bij wijze van benadering en waarschuwt u dat het resultaat exploratief is.

De correctie voor meervoudig testen is daarentegen onmisbaar. Een volcano test duizenden genen in één keer; zonder correctie zou een deel ervan „significant” uitkomen door louter toeval. Charlie past standaard de Benjamini-Hochberg-correctie toe, die het aandeel foutieve ontdekkingen onder controle houdt — het juiste compromis voor een analyse op deze schaal. De Bonferroni- of Holm-correcties, die eveneens beschikbaar zijn, zijn veel strenger: bedoeld om ook maar het minste vals-positieve te weren, worden ze te conservatief op duizenden genen en dreigen ze een nochtans reëel signaal uit te wissen. Bewaar ze voor bijzondere gevallen.

Ten slotte is het de groepsgrootte die de power bepaalt van de analyse. Met één enkel monster per groep is geen enkele test mogelijk; met twee tot vier blijft de power zeer beperkt en zijn de resultaten slechts indicatief; pas met ruimere groepen worden de conclusies solide. Charlie signaleert deze situaties rechtstreeks daar waar u de analyse configureert, want kleine aantallen in combinatie met strikte drempels leiden vaak tot „geen enkel significant gen”, zelfs wanneer er werkelijk een zwak signaal bestaat.

Naast uw analyses kent een conversationele assistent uw dataset en het geheel van uw resultaten. U kunt hem vragen om een stap, een keuze of een figuur in duidelijke taal uit te leggen, een resultaat te becommentariëren, of u een analyse voor te stellen die overeenkomt met wat u zoekt — het staat u vrij die aan te passen, te valideren en te starten. Omdat de assistent steunt op uw werkelijke gegevens en niet op algemeenheden, blijven zijn suggesties concreet en afgestemd op uw dataset. De ondersteuning wordt geleidelijk uitgebreid: op dit moment blijft bijvoorbeeld het definiëren van de vergelijkingsgroepen aan u.

De betrouwbaarheid van een analyse hangt in de eerste plaats af van uw gegevens en uw keuzes; Charlie treedt niet in de plaats daarvan, maar signaleert wat uw aandacht verdient, rechtstreeks daar waar u de analyse configureert. Charlie waarschuwt u met name wanneer een groep te weinig monsters telt voor een solide vergelijking, wanneer de schaal van de gegevens dubbelzinnig is, of wanneer het om ruwe tellingen gaat, waarvoor de differentiële analyse exploratief blijft (de specifieke methode, zoals DESeq2, is in ontwikkeling).

De keuze van de statistische methode past zich bovendien aan uw gegevens aan — de gemodereerde t-test (limma) standaard, de Welch-test als u die verkiest. En als iets u ontgaat, kan de assistent u een voorbehoud uitleggen of een voorzichtiger instelling voorstellen. Het doel is niet om in uw plaats te beslissen, maar om te voorkomen dat u op een wankele basis besluiten trekt zonder het te weten.

In de loop van uw analyses spot u interessante genen — bijvoorbeeld de sterkst differentiële. U verzamelt ze in het Mandje, dat uw werklijst wordt. Het tabblad Verrijking benut deze lijst vervolgens om een fundamentele vraag te beantwoorden: delen deze genen een functie, een route of een biologisch proces? Charlie bevraagt de grote kennisbanken — Gene Ontology, KEGG, Reactome, onder andere — en licht de significant oververtegenwoordigde termen uit, om van een eenvoudige lijst genen naar een biologische interpretatie over te gaan.

Charlie is ontworpen opdat u zelf kunt oordelen, in plaats van blind vertrouwen te schenken. Drie principes vormen daarbij de leidraad.

Het eerste is transparantie: elke beslissing die over uw gegevens wordt genomen — de gedetecteerde schaal, de toegepaste transformatie, de geweerde genen, de kwaliteitswaarschuwingen — wordt weergegeven en is aanpasbaar. Niets gebeurt in stilte.

Het tweede is uitleg: de geïntegreerde assistent kan u in duidelijke taal een stap, een keuze of een resultaat uitleggen, en uw aandacht vestigen op de interpretatievalkuilen.

Het derde is de validatie op echte gegevens: de methoden van Charlie worden getoetst aan gepubliceerde datasets waarvan de biologie bekend is, om te controleren dat ze de verwachte signalen wel degelijk terugvinden (zie de volgende vraag).

Tot slot een punt van eerlijkheid: Charlie beperkt het risico op stille fouten en signaleert zijn grenzen, maar vervangt uw wetenschappelijk oordeel niet. Voor een publicatie blijft de beoordeling door een expert aanbevolen.

Wij toetsen Charlie regelmatig aan een reeks gepubliceerde datasets waarvan de biologische respons vooraf bekend is, en wij controleren of Charlie de juiste signalen terugvindt — niet alleen of de berekening wordt uitgevoerd. Twee studies dienen vandaag als referentie: de ene bij de mens (luchtwegcellen behandeld met dexamethason), de andere bij de fruitvlieg (uitschakeling van het gen Pasilla).

Bij elk daarvan controleren wij bijvoorbeeld of de verwachte groepen zich goed scheiden na voorbereiding van de gegevens, of de sequencingdiepte de analyse niet langer domineert, en of de verwachte genen in de juiste richting naar voren komen — zoals CRISPLD2, geïnduceerd door dexamethason in de menselijke studie, of het gen Pasilla zelf, onderdrukt in de studie waar het nu juist was uitgeschakeld.

Twee belangrijke preciseringen. Deze validatie betreft een steekproef van referentiedatasets (vandaag twee, andere op komst), en niet „alle RNA-seq”: ze bevestigt de betrouwbaarheid van de methode, niet de juistheid van een specifieke analyse uitgevoerd op uw eigen gegevens. Bovendien bevestigt ze dat de biologie correct naar voren komt, maar streeft ze geen gelijkheid tot op het cijfer na met een specifieke RNA-seq-methode (DESeq2), die nog in ontwikkeling is.