Vanlige spørsmål — Charlie Bioinformatikk

Charlie arbeider ut fra en ekspresjonsmatrise: en tabell der genene står i rader og prøvene dine i kolonner. To store datafamilier støttes fra ende til ende — DNA-brikker (microarray), der verdiene allerede er i logaritmisk skala, og allerede normalisert RNA-seq (i CPM, TPM eller FPKM).

Du kan også laste opp rå tellinger fra RNA-seq. Charlie aksepterer dem og forbereder dem korrekt for utforsking (hovedkomponentanalyse, varmekart, grupperinger). Differensialanalyse på rå tellinger forblir derimot utforskende: den statistiske referansemetoden for dette tilfellet — en negativ binomisk modell, som DESeq2 — er under utvikling. Charlie varsler deg om det før analysen startes.

Tabellen nedenfor leses rad for rad: filtypen du har for hånden, skalaen på verdiene, behandlingen Charlie automatisk bruker på den, og analysene som da åpnes for deg.

Alle disse dataene måler det samme — genuttrykk, altså RNA. Microarray og RNA-seq skiller seg bare i måten det måles på. Betegnelsen «allerede normalisert» viser til korreksjonen for sekvenseringsdybde, som er særegen for RNA-seq: en prøve som er sekvensert dypere gir høyere verdier overalt uten at noe gen faktisk uttrykkes mer, og CPM, TPM eller FPKM korrigerer denne rent tekniske skjevheten. Siden en microarray ikke sekvenserer, gjelder ikke dette begrepet den.

Til slutt et ord om begrepet «rå», som dekker to svært forskjellige virkeligheter. Rå tellinger er allerede en tabell over gener og prøver, bare ennå ikke korrigert for sekvenseringsdybde: Charlie aksepterer dem. Sekvenseringsfiler (FASTQ) er noe helt annet — avlesningene som kommer ut av sekvensatoren, langt oppstrøms for enhver tabell. Charlie behandler dem ikke: den tar alltid utgangspunkt i en allerede etablert ekspresjonsmatrise.

Du kan arbeide ut fra dine egne filer eller et offentlig datasett. I det første tilfellet importerer du en tabell fra din egen maskin, i formatene Excel, CSV eller TSV. I det andre er det nok å oppgi en GEO-identifikator (på formen GSE…): Charlie henter da datasettet direkte fra den offentlige databasen NCBI GEO, uten at du selv trenger å laste det ned.

Hvert prosjekt viser øverst sin opprinnelse og sine viktigste kjennetegn — tittelen på studien, antall prøver og gener, den detekterte skalaen, og, for et GEO-datasett, dets aksesjons- og plattformidentifikatorer. Et datasett som allerede er importert kan dessuten gjenbrukes til et nytt prosjekt, uten å importere det på nytt.

Charlie organiserer arbeidet i fem faner, som følger den naturlige rekkefølgen i en analyse.

Alt starter i fanen Data, der du forbereder datasettet ditt: Charlie gjenkjenner genene dine, kontrollerer måleskalaen, lar deg definere sammenligningsgruppene dine og bla gjennom en oversikt over variablene dine. Deretter kommer Analyser, der du bygger dine fremstillinger — hovedkomponenter, varmekart, volcano — i form av trinn som du kjeder sammen etter hvert som undersøkelsen skrider frem. Genene som fanger oppmerksomheten din, samler du i Kurv. Ut fra denne kurven trekker fanen Anrikning ut de biologiske funksjonene og reaksjonsveiene som er overrepresentert. Til slutt vil Bibliografi, som kommer, knytte genene dine til den vitenskapelige litteraturen.

Fanen Data samler alt som forbereder og beskriver datasettet ditt før analysen, i tre deler.

Den første, Klargjøring av data, er kjernen. Her gjenkjenner Charlie genene dine (se neste spørsmål), og lar deg deretter fjerne identifikatorene den ikke kunne annotere og kolonnene som ikke er gener, filtrere bort manglende verdier, og — hvis kvalitetskontrollen antyder det — normalisere prøvene for å gjøre dem sammenlignbare. Hver gang gir Charlie en anbefaling, men avgjørelsen er din.

Den andre delen lar deg opprette dine egne grupper av prøver ut fra variablene dine (etter behandling, etter tilstand…), for å forberede sammenligningene i fanen Analyser.

Den tredje, Dataoversikt, gir en umiddelbar helhetsoversikt: et utdrag av matrisen, et sammendrag av de detekterte kategoriske variablene (behandling, kilde, osv.), og rangeringen av de femti mest variable genene — et første blikk på hva som skiller prøvene dine, allerede før du har startet en analyse.

En ekspresjonsfil inneholder sjelden lesbare gennavn: som oftest er det probenumre (for eksempel ILMN_1802380) eller identifikatorer fra databaser (Entrez, Ensembl). Å knytte dem til gennavn én etter én er et langt og feilutsatt arbeid, ikke minst fordi man må ta hensyn til navn som har endret seg over tid.

Charlie tar seg av dette automatisk. Ved import gjenkjenner den typen på identifikatorene dine, oversetter dem til gennavn, og oppdaterer dem som har blitt utdaterte til den gjeldende nomenklaturen. Slik får du et datasett som er klart for analyse, der genene bærer sitt gjeldende navn — uten å ha skrevet en eneste linje kode eller slått opp i en oppslagstabell.

Fremfor alt presenteres resultatet for deg uten tvetydighet. Feltet «Annotering» viser andelen gjenkjente gener (for eksempel «8 763 av 9 980»), annoteringens opprinnelse, og listen over identifikatorene som ikke kunne knyttes — utelatt fra analysene i stedet for feilaktig medregnet. Du vet dermed alltid hva Charlie har gjenkjent og hva den har lagt til side.

Charlie annoterer automatisk genene til ni ofte studerte arter: menneske, mus, rotte, bananflue, sebrafisk, rundormen C. elegans, bakegjær, modellplanten Arabidopsis og bakterien E. coli. For å få til dette kombinerer den flere annoteringskilder, hvis tilgjengelighet avhenger av arten. Tabellen nedenfor oppsummerer virkemidlene som brukes for hver enkelt.

For disse ni artene bygger oversettelsen av identifikatorene på referanse- annoteringsdatabasene i Bioconductor (kolonnen «Oversettelse»), en garanti for pålitelige gennavn. Oppdateringen av utdaterte navn hviler på nomenklaturmyndigheten som er særegen for hver art — HGNC for menneske, FlyBase for bananflue, og så videre. Den er ikke tilgjengelig for gjær eller Arabidopsis, hvis databaser ikke leverer en synonymtabell; tapet er lite, da disse artene har få gamle navn i omløp. Den direkte gjenkjenningen av Illumina-brikker gjelder til slutt bare menneske, mus og rotte, i mangel av tilsvarende brikker for de andre artene.

Hvis du arbeider med en art som ikke står på denne listen, er analysen fortsatt mulig: Charlie bruker annoteringen som GEO leverer når den finnes, ellers beholdes identifikatorene dine slik de er, og du kan levere din egen korrespondansefil. Uansett angir den tydelig når den automatiske annoteringen ikke er tilgjengelig, i stedet for å la deg tro på et resultat.

Før enhver analyse detekterer Charlie skalaen på verdiene dine: dreier det seg om rå tellinger, normaliserte data, eller verdier som allerede er i logaritmisk skala? Denne deteksjonen bestemmer behandlingen som brukes. For eksempel, for en hovedkomponentanalyse blir rå tellinger først normalisert og deretter logaritmert, slik at sekvenseringsdybden ikke maskerer det biologiske signalet; data som allerede er logaritmiske, blir derimot latt urørt for å unngå en dobbel logaritmering.

Alt Charlie detekterer og bruker blir vist: den gjenkjente skalaen, transformasjonen som brukes, genene som eventuelt utelates. Du kan kontrollere det, og hvis den automatiske deteksjonen tar feil eller er usikker, korrigere skalaen selv.

Avhengig av hva Charlie detekterer, er dette hva den forbereder og hva du kan gjøre med det:

For enhver differensialanalyse er resultatet en fold-change i log2, en korreksjon for multiple tester brukes (Benjamini-Hochberg som standard), og varsler gjør oppmerksom på for små grupper.

Fanen Analyser dekker de vanligste fremstillingene: kvalitetskontroll av prøvene, hovedkomponentanalyse og UMAP for å visualisere strukturen i dataene, varmekart og korrelasjoner, fordelinger, og differensiell ekspresjon (volcano og MA-plot). For å starte en av dem legger du til et trinn og angir, avhengig av analysen, gruppene som skal sammenlignes eller de ønskede parameterne.

Du kan gå frem på to måter. Enten bygger du analysene selv, ved å velge hvert trinn og innstillingene. Eller du støtter deg på Charlie-assistenten, som kan foreslå en analyse ut fra kriteriene dine og veilede deg (se lenger ned). I begge tilfeller er det du som godkjenner og starter beregningen.

Hver analyse presenteres i form av et trinn som legges til rapporten din, og som samler all konteksten til resultatet på ett sted. Der finner du grafen selv, sammen med informasjonen som beskriver den; justeringsparametere som du kan endre, og hvis virkning noen ganger gjenspeiles direkte på figuren; en forklarende bildetekst, generert på forespørsel, for å tolke resultatet; beregningsdetaljene, som minner om metoden og innstillingene som er brukt; eventuelle kvalitetsvarsler; og en dataoversikt over dataene som ble brukt til å produsere grafen. Slik ser du ikke bare resultatet, men også hvordan det ble oppnådd.

Disse trinnene kjedes fritt sammen: du samler dem opp for å drive undersøkelsen din, fra en helhetsoversikt mot de bestemte genene som interesserer deg — som du da legger i Kurv.

Volcano er analysen for differensiell ekspresjon: den svarer på spørsmålet «hvilke gener uttrykkes forskjellig mellom de to gruppene mine?». Hvert gen plasseres langs to akser — størrelsen på endringen (log2 fold-change, horisontalt) og den statistiske soliditeten til resultatet (den korrigerte p-value, vertikalt). Et gen erklæres bare «signifikant» hvis det samtidig passerer en terskel for størrelse og en terskel for p-value: en stor endring med lav pålitelighet, eller et pålitelig men bittelite resultat, holder ikke. To innstillinger, samlet i de avanserte alternativene for analysen, styrer dette utfallet.

Den statistiske testen tilpasser seg dataenes natur. Charlie velger som standard moderert t-test (limma), den historiske referansen for ekspresjonsanalyse: i stedet for å estimere variabiliteten til hvert gen isolert — noe som er svært usikkert når prøvene er få — konsoliderer den dette estimatet ved å støtte seg på samtlige gener i datasettet. Gevinsten er tydelig for små grupper, den vanligste situasjonen. Welch-testen, mer klassisk, tilbys fortsatt: for godt fylte grupper konvergerer de to metodene mot samme resultat, slik at valget da nesten ikke har noen betydning.

På rå tellinger fra RNA-seq er ingen av disse to testene ideell: referansemetodene bygger på en modell laget for tellinger, som DESeq2 eller edgeR, fortsatt under utvikling. Charlie bruker da en t-test som tilnærming og varsler deg om at resultatet er utforskende.

Den korreksjonen for multiple tester er på sin side uunnværlig. En volcano tester tusenvis av gener på én gang; uten korreksjon ville en del av dem fremstå som «signifikante» kun på grunn av tilfeldigheter. Charlie bruker som standard Benjamini-Hochberg-korreksjonen, som holder styr på andelen falske funn — det gode kompromisset for en analyse i denne skalaen. Korreksjonene Bonferroni eller Holm, som også tilbys, er langt strengere: laget for å utelukke selv det minste falske positive, blir de for konservative på tusenvis av gener og risikerer å viske ut et signal som likevel er reelt. Reserver dem til spesielle tilfeller.

Til slutt er det gruppestørrelsen som bestemmer styrken i analysen. Med bare én prøve per gruppe er ingen test mulig; med to til fire forblir styrken svært begrenset og resultatene gjelder bare som veiledende; det er først med godt fylte grupper at konklusjonene blir solide. Charlie varsler om disse situasjonene direkte der du konfigurerer analysen, for små utvalg kombinert med strenge terskler ender ofte i «ingen signifikante gener», selv når et svakt signal faktisk finnes.

Ved siden av analysene dine kjenner en samtaleassistent datasettet ditt og alle resultatene dine. Du kan be den forklare et trinn, et valg eller en figur i klart språk, kommentere et resultat, eller foreslå en analyse som svarer til det du leter etter — det står deg fritt å justere, godkjenne og starte den. Siden den støtter seg på dine reelle data og ikke på generaliteter, forblir forslagene konkrete og tilpasset datasettet ditt. Assistansen utvides gradvis: per i dag er for eksempel definisjonen av sammenligningsgruppene fortsatt din oppgave.

Påliteligheten til en analyse avhenger først og fremst av dataene og valgene dine; Charlie erstatter ikke dette, men varsler om det som fortjener oppmerksomheten din, direkte der du konfigurerer analysen. Den varsler deg blant annet når en gruppe har for få prøver til en solid sammenligning, når skalaen på dataene er tvetydig, eller når det dreier seg om rå tellinger, som differensialanalysen forblir utforskende for (den dedikerte metoden, som DESeq2, er under utvikling).

Valget av statistisk metode tilpasser seg for øvrig dataene dine — moderert t-test (limma) som standard, Welch-testen hvis du foretrekker det. Og hvis noe unngår deg, kan assistenten forklare deg et forbehold eller foreslå en mer forsiktig innstilling. Målet er ikke å bestemme på dine vegne, men å hindre deg i å konkludere på et skjørt grunnlag uten å vite det.

Etter hvert i analysene dine oppdager du interessante gener — de sterkest differensielle, for eksempel. Du samler dem i Kurv, som blir arbeidslisten din. Fanen Anrikning utnytter deretter denne listen for å svare på et grunnleggende spørsmål: deler disse genene en funksjon, en reaksjonsvei eller en biologisk prosess? Charlie spør de store kunnskapsdatabasene — Gene Ontology, KEGG, Reactome, blant andre — og fremhever termene som er signifikant overrepresentert, for å gå fra en enkel liste over gener til en biologisk tolkning.

Charlie er utformet slik at du kan dømme selv, i stedet for å gi blind tillit. Tre prinsipper styrer den.

Det første er åpenhet: hver beslutning som tas om dataene dine — den detekterte skalaen, transformasjonen som brukes, genene som utelates, kvalitetsvarslene — vises og kan endres. Ingenting skjer i det stille.

Det andre er forklaring: den integrerte assistenten kan forklare deg i klart språk et trinn, et valg eller et resultat, og gjøre deg oppmerksom på tolkningsfeller.

Det tredje er validering på reelle data: Charlies metoder konfronteres med publiserte datasett, hvis biologi er kjent, for å kontrollere at de faktisk gjenfinner de forventede signalene (se neste spørsmål).

Et poeng om ærlighet, til slutt: Charlie reduserer risikoen for stille feil og varsler om sine begrensninger, men den erstatter ikke din vitenskapelige vurdering. For en publikasjon er gjennomlesing av en ekspert fortsatt anbefalt.

Vi konfronterer jevnlig Charlie med et sett publiserte datasett, hvis biologiske respons er kjent på forhånd, og vi kontrollerer at den gjenfinner de rette signalene — ikke bare at beregningen kjører. To studier tjener i dag som referanse: den ene hos menneske (celler fra luftveiene behandlet med deksametason), den andre hos bananflue (utslåing av genet Pasilla).

På hver av dem kontrollerer vi for eksempel at de forventede gruppene skiller seg godt etter klargjøring av data, at sekvenseringsdybden ikke lenger dominerer analysen, og at de forventede genene kommer frem i riktig retning — som CRISPLD2, indusert av deksametason i den humane studien, eller genet Pasilla selv, undertrykt i studien der det nettopp ble slått ut.

To viktige presiseringer. Denne valideringen gjelder et utvalg av referansedatasett (to i dag, flere kommer), og ikke «all RNA-seq»: den bekrefter påliteligheten til metoden, ikke riktigheten av en bestemt analyse utført på dine egne data. Dessuten bekrefter den at biologien kommer korrekt frem, men tar ikke sikte på eksakt tallmessig likhet med en dedikert RNA-seq-metode (DESeq2), fortsatt under utvikling.