Najczęściej zadawane pytania — Charlie Bioinformatyka

Charlie pracuje na podstawie macierzy ekspresji: tabeli, w której geny znajdują się w wierszach, a Państwa próbki w kolumnach. Kompleksowo obsługiwane są dwie główne rodziny danych — mikromacierze DNA (microarray), których wartości są już w skali logarytmicznej, oraz już znormalizowany RNA-seq (w CPM, TPM lub FPKM).

Mogą Państwo również wczytać surowe zliczenia z RNA-seq. Charlie je akceptuje i prawidłowo przygotowuje do eksploracji (analiza głównych składowych, mapy cieplne, grupowania). Natomiast analiza różnicowa na surowych zliczeniach pozostaje eksploracyjna: referencyjna metoda statystyczna dla tego przypadku — model ujemnego rozkładu dwumianowego, taki jak DESeq2 — jest w trakcie opracowywania. Charlie sygnalizuje to Państwu przed uruchomieniem analizy.

Poniższą tabelę czyta się wiersz po wierszu: typ pliku, którym Państwo dysponują, skala jego wartości, przetwarzanie, które Charlie stosuje do niego automatycznie, oraz analizy, które stają się wówczas dostępne.

Wszystkie te dane mierzą to samo — ekspresję genów, czyli RNA. Microarray i RNA-seq różnią się jedynie sposobem jej pomiaru. Określenie „już znormalizowany” odnosi się do korekcji głębokości sekwencjonowania, właściwej dla RNA-seq: próbka bardziej zsekwencjonowana daje wszędzie wyższe wartości, choć żaden gen nie ulega w rzeczywistości silniejszej ekspresji, a CPM, TPM lub FPKM korygują to czysto techniczne obciążenie. Ponieważ microarray nie sekwencjonuje, pojęcie to go nie dotyczy.

Na koniec słowo o terminie „surowe”, który kryje dwa bardzo różne znaczenia. Surowe zliczenia to już tabela genów i próbek, po prostu jeszcze nieskorygowana o głębokość sekwencjonowania: Charlie je akceptuje. Pliki sekwencjonowania (FASTQ) to coś zupełnie innego — odczyty wychodzące z sekwenatora, na długo przed jakąkolwiek tabelą. Charlie ich nie przetwarza: zawsze wychodzi od już utworzonej macierzy ekspresji.

Mogą Państwo pracować na podstawie własnych plików lub publicznego zbioru danych. W pierwszym przypadku importują Państwo tabelę ze swojego komputera, w formatach Excel, CSV lub TSV. W drugim wystarczy podać identyfikator GEO (o postaci GSE…): Charlie pobiera wówczas zbiór danych bezpośrednio z publicznej bazy NCBI GEO, bez konieczności samodzielnego pobierania go przez Państwa.

Każdy projekt wyświetla w nagłówku swoje pochodzenie i główne cechy — tytuł badania, liczbę próbek i genów, wykrytą skalę, a w przypadku zbioru GEO jego identyfikatory dostępu i platformy. Zaimportowany już zbiór danych można ponadto wykorzystać ponownie w nowym projekcie, bez ponownego importowania.

Charlie organizuje pracę w pięciu zakładkach, które podążają za naturalną kolejnością analizy.

Wszystko zaczyna się od zakładki Dane, w której przygotowują Państwo swój zbiór: Charlie rozpoznaje w niej Państwa geny, kontroluje skalę pomiarów, pozwala zdefiniować grupy porównawcze i przejrzeć podgląd zmiennych. Następnie przychodzą Analizy, w których budują Państwo swoje reprezentacje — główne składowe, mapy cieplne, volcano — w postaci kroków łączonych w miarę prowadzenia badania. Geny, które przykuwają Państwa uwagę, gromadzą Państwo w Koszyku. Na podstawie tego koszyka zakładka Wzbogacenie wyłania nadreprezentowane funkcje i szlaki biologiczne. Wreszcie Bibliografia, w przygotowaniu, połączy Państwa geny z literaturą naukową.

Zakładka Dane skupia wszystko, co przygotowuje i opisuje Państwa zbiór przed analizą, w trzech częściach.

Pierwsza, Przygotowanie danych, stanowi jej sedno. Charlie rozpoznaje w niej Państwa geny (patrz następne pytanie), a następnie pozwala odrzucić identyfikatory, których nie udało się opatrzyć adnotacją, oraz kolumny niebędące genami, odfiltrować brakujące wartości i — jeśli kontrola jakości to sugeruje — znormalizować próbki, aby uczynić je porównywalnymi. Za każdym razem Charlie przedstawia zalecenie, ale decyzja należy do Państwa.

Druga część pozwala utworzyć własne grupy próbek na podstawie Państwa zmiennych (według traktowania, według warunku…), aby przygotować porównania z zakładki Analizy.

Trzecia, Podgląd danych, daje ich natychmiastowy przegląd całości: fragment macierzy, podsumowanie wykrytych zmiennych kategorialnych (traktowanie, źródło itd.) oraz ranking pięćdziesięciu najbardziej zmiennych genów — pierwsze spojrzenie na to, co odróżnia Państwa próbki, jeszcze przed uruchomieniem analizy.

Plik ekspresji rzadko zawiera czytelne nazwy genów: najczęściej są to numery sond (na przykład ILMN_1802380) lub identyfikatory baz danych (Entrez, Ensembl). Dopasowywanie ich pojedynczo do nazw genów to praca długa i podatna na błędy, tym bardziej że trzeba uwzględnić nazwy, które zmieniały się z biegiem czasu.

Charlie zajmuje się tym automatycznie. Podczas importu rozpoznaje typ Państwa identyfikatorów, tłumaczy je na nazwy genów i aktualizuje te, które stały się przestarzałe, do obowiązującej nomenklatury. W ten sposób otrzymują Państwo zbiór danych gotowy do analizy, którego geny noszą swoją bieżącą nazwę — bez napisania choćby jednej linijki kodu ani zaglądania do tabeli odpowiedników.

Przede wszystkim wynik jest przedstawiany Państwu jednoznacznie. Baner „Adnotacja” wskazuje odsetek rozpoznanych genów (na przykład „8 763 z 9 980”), pochodzenie adnotacji oraz listę identyfikatorów, których nie udało się powiązać — odrzuconych z analiz, zamiast błędnie zaliczonych. Zawsze wiedzą więc Państwo, co Charlie rozpoznał i co pominął.

Charlie automatycznie opatruje adnotacją geny dziewięciu powszechnie badanych gatunków: człowieka, myszy, szczura, muszki owocowej, danio pręgowanego, nicienia C. elegans, drożdży piekarniczych, rośliny modelowej Arabidopsis oraz bakterii E. coli. Aby to osiągnąć, łączy kilka źródeł adnotacji, których dostępność zależy od gatunku. Poniższa tabela podsumowuje środki wykorzystane dla każdego z nich.

Dla tych dziewięciu gatunków tłumaczenie identyfikatorów opiera się na referencyjnych bazach adnotacji Bioconductor (kolumna „Tłumaczenie”), co gwarantuje wiarygodne nazwy genów. Aktualizacja przestarzałych nazw opiera się na autorytecie nomenklaturowym właściwym dla każdego gatunku — HGNC dla człowieka, FlyBase dla muszki owocowej i tak dalej. Nie jest ona dostępna dla drożdży ani dla Arabidopsis, których bazy nie dostarczają tabeli synonimów; strata jest niewielka, ponieważ gatunki te mają niewiele dawnych nazw w obiegu. Wreszcie bezpośrednie rozpoznawanie mikromacierzy Illumina dotyczy jedynie człowieka, myszy i szczura, z braku równoważnych mikromacierzy dla pozostałych gatunków.

Jeśli pracują Państwo nad gatunkiem nieobecnym na tej liście, analiza pozostaje możliwa: Charlie korzysta z adnotacji dostarczonej przez GEO, jeśli taka istnieje, w przeciwnym razie Państwa identyfikatory są zachowywane w niezmienionej postaci i mogą Państwo dostarczyć własny plik odpowiedników. W każdym przypadku Charlie wyraźnie wskazuje, kiedy automatyczna adnotacja jest niedostępna, zamiast pozostawiać Państwa w przekonaniu, że wynik istnieje.

Przed każdą analizą Charlie wykrywa skalę Państwa wartości: czy są to surowe zliczenia, dane znormalizowane, czy wartości już w skali logarytmicznej? To wykrycie decyduje o zastosowanym przetwarzaniu. Na przykład w analizie głównych składowych surowe zliczenia są najpierw normalizowane, a następnie poddawane logarytmowaniu, aby głębokość sekwencjonowania nie przesłaniała sygnału biologicznego; dane już logarytmiczne pozostają natomiast nietknięte, aby uniknąć podwójnego logarytmowania.

Wszystko, co Charlie wykrywa i stosuje, jest wyświetlane: rozpoznana skala, zastosowane przekształcenie, ewentualnie odrzucone geny. Mogą to Państwo sprawdzić, a jeśli automatyczne wykrywanie się myli lub pozostaje niepewne, samodzielnie skorygować skalę.

W zależności od tego, co Charlie wykryje, oto co przygotowuje i co można z tym zrobić:

W każdej analizie różnicowej wynikiem jest fold-change w log2, stosowana jest korekcja na testowanie wielokrotne (Benjamini-Hochberg domyślnie), a alerty sygnalizują zbyt małe grupy.

Zakładka Analizy obejmuje najczęstsze reprezentacje: kontrolę jakości próbek, analizę głównych składowych i UMAP do wizualizacji struktury danych, mapy cieplne i korelacje, rozkłady oraz ekspresję różnicową (volcano i MA-plot). Aby uruchomić którąś z nich, dodają Państwo krok i wskazują, w zależności od analizy, grupy do porównania lub żądane parametry.

Mogą Państwo postępować na dwa sposoby. Albo budują Państwo swoje analizy samodzielnie, wybierając każdy krok i jego ustawienia. Albo korzystają Państwo z asystenta Charlie, który może zaproponować analizę na podstawie Państwa kryteriów i poprowadzić Państwa (patrz niżej). W obu przypadkach to Państwo zatwierdzają i uruchamiają obliczenie.

Każda analiza przyjmuje postać kroku dodanego do Państwa raportu, który gromadzi w jednym miejscu cały kontekst wyniku. Znajdują się tam: sam wykres, wraz z informacjami, które go charakteryzują; parametry dostosowania, które można modyfikować, a których efekt niekiedy odzwierciedla się na żywo na rysunku; objaśniająca legenda, generowana na żądanie, do interpretacji wyniku; szczegóły obliczenia, przypominające zastosowaną metodę i ustawienia; ewentualne alerty jakości; oraz podgląd danych, które posłużyły do wytworzenia wykresu. Widzą więc Państwo nie tylko wynik, ale również sposób, w jaki został uzyskany.

Kroki te łączą się swobodnie: gromadzą je Państwo, aby prowadzić swoje badanie, od widoku całościowego ku konkretnym genom, które Państwa interesują — i które następnie umieszczają Państwo w Koszyku.

Volcano to analiza ekspresji różnicowej: odpowiada na pytanie „które geny ulegają ekspresji w różnym stopniu między moimi dwiema grupami?”. Każdy gen jest na nim umieszczony według dwóch osi — wielkości zmiany (log2 fold-change, w poziomie) oraz statystycznej solidności wyniku (skorygowana p-value, w pionie). Gen jest uznawany za „istotny” tylko wtedy, gdy przekracza jednocześnie próg wielkości i próg p-value: silna, lecz mało wiarygodna zmiana albo wynik wiarygodny, lecz znikomy, nie wystarcza. Dwa ustawienia, zebrane w opcjach zaawansowanych analizy, rządzą tym werdyktem.

Test statystyczny dostosowuje się do charakteru Państwa danych. Charlie domyślnie wybiera moderowany test t (limma), historyczny punkt odniesienia analizy ekspresji: zamiast szacować zmienność każdego genu z osobna — co jest bardzo niepewne, gdy próbek jest niewiele — konsoliduje to oszacowanie, opierając się na wszystkich genach zbioru. Zysk jest wyraźny w przypadku małych grup, czyli najczęstszej sytuacji. Test Welcha, bardziej klasyczny, pozostaje dostępny: przy licznych grupach obie metody zbiegają się do tego samego wyniku, tak że wybór nie ma wówczas praktycznie żadnego znaczenia.

Na surowych zliczeniach RNA-seq żaden z tych dwóch testów nie jest idealny: metody referencyjne opierają się na modelu zaprojektowanym dla zliczeń, takim jak DESeq2 lub edgeR, wciąż w fazie rozwoju. Charlie stosuje wówczas test t jako przybliżenie i uprzedza Państwa, że wynik jest eksploracyjny.

Korekcja na testowanie wielokrotne jest z kolei niezbędna. Volcano testuje tysiące genów za jednym razem; bez korekcji część z nich okazałaby się „istotna” wyłącznie za sprawą przypadku. Charlie stosuje domyślnie korekcję Benjamini-Hochberg, która kontroluje odsetek fałszywych odkryć — właściwy kompromis dla analizy na taką skalę. Korekcje Bonferroni lub Holm, również dostępne, są znacznie surowsze: pomyślane, aby odrzucić najmniejszy fałszywie dodatni wynik, stają się zbyt zachowawcze przy tysiącach genów i grożą usunięciem sygnału, który mimo wszystko jest rzeczywisty. Proszę zarezerwować je do przypadków szczególnych.

To wreszcie wielkość grup decyduje o mocy analizy. Przy jednej próbce na grupę żaden test nie jest możliwy; przy dwóch do czterech moc pozostaje bardzo ograniczona, a wyniki mają jedynie charakter orientacyjny; dopiero przy liczniejszych grupach wnioski stają się solidne. Charlie sygnalizuje te sytuacje bezpośrednio tam, gdzie konfigurują Państwo analizę, ponieważ małe liczebności w połączeniu ze ścisłymi progami często prowadzą do „braku istotnych genów”, nawet gdy słaby sygnał rzeczywiście istnieje.

Obok Państwa analiz asystent konwersacyjny zna Państwa zbiór danych oraz wszystkie Państwa wyniki. Mogą Państwo poprosić go o objaśnienie kroku, wyboru lub rysunku prostym językiem, o skomentowanie wyniku albo o zaproponowanie analizy odpowiadającej temu, czego Państwo szukają — z możliwością jej dostosowania, zatwierdzenia i uruchomienia. Ponieważ opiera się on na Państwa rzeczywistych danych, a nie na ogólnikach, jego sugestie pozostają konkretne i dopasowane do Państwa zbioru. Wsparcie stopniowo się rozwija: obecnie na przykład definiowanie grup porównawczych pozostaje w Państwa gestii.

Wiarygodność analizy zależy przede wszystkim od Państwa danych i decyzji; Charlie ich nie zastępuje, ale sygnalizuje to, co zasługuje na Państwa uwagę, bezpośrednio tam, gdzie konfigurują Państwo analizę. Ostrzega w szczególności, gdy grupa liczy zbyt mało próbek do solidnego porównania, gdy skala danych jest niejednoznaczna lub gdy chodzi o surowe zliczenia, dla których analiza różnicowa pozostaje eksploracyjna (dedykowana metoda, taka jak DESeq2, jest w fazie rozwoju).

Wybór metody statystycznej dostosowuje się ponadto do Państwa danych — domyślnie moderowany test t (limma), test Welcha, jeśli Państwo go preferują. A jeśli jakiś punkt Państwu umyka, asystent może objaśnić zastrzeżenie lub zasugerować ostrożniejsze ustawienie. Celem nie jest decydowanie za Państwa, lecz uchronienie Państwa przed wyciąganiem wniosków na kruchej podstawie, nieświadomie.

W trakcie analiz dostrzegają Państwo interesujące geny — na przykład najsilniej różnicowe. Gromadzą je Państwo w Koszyku, który staje się Państwa listą roboczą. Zakładka Wzbogacenie wykorzystuje następnie tę listę, aby odpowiedzieć na zasadnicze pytanie: czy te geny mają wspólną funkcję, szlak lub proces biologiczny? Charlie odpytuje wielkie bazy wiedzy — Gene Ontology, KEGG, Reactome i inne — i uwypukla terminy istotnie nadreprezentowane, aby przejść od zwykłej listy genów do interpretacji biologicznej.

Charlie został zaprojektowany tak, aby mogli Państwo oceniać samodzielnie, zamiast obdarzać go ślepym zaufaniem. Kierują nim trzy zasady.

Pierwsza to przejrzystość: każda decyzja podjęta wobec Państwa danych — wykryta skala, zastosowane przekształcenie, odrzucone geny, alerty jakości — jest wyświetlana i możliwa do zmiany. Nic nie dzieje się w ciszy.

Druga to objaśnienie: wbudowany asystent może objaśnić Państwu prostym językiem krok, wybór lub wynik oraz zwrócić Państwa uwagę na pułapki interpretacyjne.

Trzecia to walidacja na rzeczywistych danych: metody Charlie są konfrontowane z opublikowanymi zbiorami danych, których biologia jest znana, aby sprawdzić, czy prawidłowo odnajdują oczekiwane sygnały (patrz następne pytanie).

Na koniec kwestia uczciwości: Charlie zmniejsza ryzyko cichego błędu i sygnalizuje swoje ograniczenia, ale nie zastępuje Państwa osądu naukowego. W przypadku publikacji zalecana pozostaje weryfikacja przez eksperta.

Regularnie konfrontujemy Charlie z zestawem opublikowanych zbiorów danych, których odpowiedź biologiczna jest znana z góry, i sprawdzamy, czy odnajduje właściwe sygnały — a nie jedynie, czy obliczenie się wykonuje. Dwa badania służą dziś jako punkt odniesienia: jedno u człowieka (komórki dróg oddechowych traktowane deksametazonem), drugie u muszki owocowej (wyłączenie genu Pasilla).

W każdym z nich sprawdzamy na przykład, czy oczekiwane grupy dobrze się rozdzielają po przygotowaniu danych, czy głębokość sekwencjonowania nie dominuje już nad analizą oraz czy oczekiwane geny ujawniają się we właściwym kierunku — jak CRISPLD2, indukowany przez deksametazon w badaniu ludzkim, lub sam gen Pasilla, wyciszony w badaniu, w którym został właśnie wyłączony.

Dwa ważne uściślenia. Ta walidacja dotyczy próbki zbiorów referencyjnych (dziś dwóch, kolejne w przygotowaniu), a nie „wszystkich danych RNA-seq”: poświadcza wiarygodność metody, a nie poprawność konkretnej analizy przeprowadzonej na Państwa własnych danych. Ponadto potwierdza, że biologia ujawnia się prawidłowo, lecz nie dąży do zgodności co do ostatniej cyfry z dedykowaną metodą RNA-seq (DESeq2), wciąż w fazie rozwoju.