Domande frequenti — Charlie Bioinformatica

Charlie lavora a partire da una matrice di espressione: una tabella in cui i geni sono disposti in righe e i suoi campioni in colonne. Due grandi famiglie di dati sono supportate integralmente — i chip a DNA (microarray), i cui valori sono già in scala logaritmica, e l'RNA-seq già normalizzato (in CPM, TPM o FPKM).

Può anche caricare conteggi grezzi di RNA-seq. Charlie li accetta e li prepara correttamente per l'esplorazione (analisi delle componenti principali, mappe di calore, raggruppamenti). L'analisi differenziale su conteggi grezzi, invece, rimane esplorativa: il metodo statistico di riferimento per questo caso — un modello binomiale negativo, come DESeq2 — è in fase di sviluppo. Charlie glielo segnala prima di avviare l'analisi.

La tabella qui sotto si legge riga per riga: il tipo di file che ha a disposizione, la scala dei suoi valori, il trattamento che Charlie vi applica automaticamente, e le analisi che le vengono così rese accessibili.

Tutti questi dati misurano la stessa cosa — l'espressione dei geni, ovvero l'RNA. Microarray e RNA-seq differiscono solo per il modo di misurarla. La dicitura «già normalizzato» rimanda alla correzione della profondità di sequenziamento, propria dell'RNA-seq: un campione sequenziato più in profondità produce valori più elevati ovunque senza che alcun gene sia realmente più espresso, e CPM, TPM o FPKM correggono questa distorsione puramente tecnica. Poiché un microarray non sequenzia, questa nozione non lo riguarda.

Un'ultima parola sul termine «grezzo», che ricopre due realtà molto diverse. I conteggi grezzi sono già una tabella di geni e campioni, semplicemente non ancora corretta per la profondità di sequenziamento: Charlie li accetta. I file di sequenziamento (FASTQ) sono tutt'altra cosa — le letture che escono dal sequenziatore, ben a monte di qualsiasi tabella. Charlie non li elabora: parte sempre da una matrice di espressione già costituita.

Può lavorare a partire dai suoi file o da un set di dati pubblico. Nel primo caso, importa una tabella dal suo computer, nei formati Excel, CSV o TSV. Nel secondo, è sufficiente indicare un identificativo GEO (nella forma GSE…): Charlie recupera così il set di dati direttamente dalla banca dati pubblica NCBI GEO, senza doverlo scaricare personalmente.

Ogni progetto mostra in cima la sua origine e le sue caratteristiche principali — il titolo dello studio, il numero di campioni e di geni, la scala rilevata, e, per un set GEO, i suoi identificativi di accessione e di piattaforma. Un set di dati già importato può inoltre essere riutilizzato per un nuovo progetto, senza doverlo reimportare.

Charlie organizza il lavoro in cinque schede, che seguono l'ordine naturale di un'analisi.

Tutto parte dalla scheda Dati, dove prepara il suo set: Charlie vi riconosce i suoi geni, controlla la scala delle misure, le permette di definire i suoi gruppi di confronto e di scorrere un'anteprima delle sue variabili. Viene poi Analisi, dove costruisce le sue rappresentazioni — componenti principali, mappe di calore, volcano — sotto forma di fasi che concatena nel corso della sua indagine. I geni che attirano la sua attenzione, li raccoglie nel Carrello. A partire da questo carrello, la scheda Arricchimento mette in luce le funzioni e le vie biologiche sovra-rappresentate. Infine, la Bibliografia, in arrivo, collegherà i suoi geni alla letteratura scientifica.

La scheda Dati riunisce tutto ciò che prepara e descrive il suo set prima dell'analisi, in tre sezioni.

La prima, Preparazione dei dati, ne è il cuore. Charlie vi riconosce i suoi geni (veda la domanda successiva), poi le permette di escludere gli identificativi che non è riuscito ad annotare e le colonne che non sono geni, di filtrare i valori mancanti e — se il controllo qualità lo suggerisce — di normalizzare i campioni per renderli comparabili. Ogni volta, Charlie propone una raccomandazione, ma la decisione spetta a Lei.

La seconda sezione le consente di creare i suoi gruppi di campioni a partire dalle sue variabili (per trattamento, per condizione…), al fine di preparare i confronti della scheda Analisi.

La terza, Anteprima dei dati, ne offre una visione d'insieme immediata: un estratto della matrice, un riepilogo delle variabili categoriali rilevate (trattamento, sorgente, ecc.), e la classifica dei cinquanta geni più variabili — un primo sguardo su ciò che distingue i suoi campioni, ancor prima di aver avviato un'analisi.

Un file di espressione contiene raramente nomi di geni leggibili: il più delle volte si tratta di numeri di sonde (per esempio ILMN_1802380) o di identificativi di banche dati (Entrez, Ensembl). Associarli uno per uno ai nomi dei geni è un lavoro lungo e soggetto a errori, tanto più che occorre tenere conto dei nomi che sono cambiati nel tempo.

Charlie se ne occupa automaticamente. All'importazione, riconosce il tipo dei suoi identificativi, li traduce in nomi di geni, e aggiorna quelli diventati obsoleti secondo la nomenclatura in vigore. Ottiene così un set di dati pronto per l'analisi, i cui geni portano il loro nome corrente — senza aver scritto una riga di codice né consultato una tabella di corrispondenza.

Soprattutto, il risultato le viene presentato senza ambiguità. Il banner «Annotazione» indica la quota di geni riconosciuti (per esempio «8.763 su 9.980»), la provenienza dell'annotazione, e l'elenco degli identificativi che non è stato possibile associare — esclusi dalle analisi anziché conteggiati erroneamente. Sa quindi sempre cosa Charlie ha riconosciuto e cosa ha lasciato da parte.

Charlie annota automaticamente i geni di nove specie comunemente studiate: l'essere umano, il topo, il ratto, la drosofila, il pesce zebra, il verme C. elegans, il lievito di birra, la pianta modello Arabidopsis e il batterio E. coli. Per riuscirci, combina diverse fonti di annotazione, la cui disponibilità dipende dalla specie. La tabella qui sotto riepiloga i mezzi impiegati per ciascuna.

Per queste nove specie, la traduzione degli identificativi si basa sulle banche dati di annotazione Bioconductor di riferimento (la colonna «Traduzione»), garanzia di nomi di geni affidabili. L'aggiornamento dei nomi obsoleti si basa sull'autorità di nomenclatura propria di ciascuna specie — HGNC per l'essere umano, FlyBase per la drosofila, e così via. Non è disponibile per il lievito né per Arabidopsis, le cui banche dati non forniscono una tabella di sinonimi; la perdita è minima, dato che queste specie hanno pochi nomi vecchi in circolazione. Il riconoscimento diretto dei chip Illumina, infine, riguarda solo l'essere umano, il topo e il ratto, per mancanza di chip equivalenti per le altre specie.

Se lavora su una specie assente da questo elenco, l'analisi resta possibile: Charlie utilizza l'annotazione fornita da GEO quando esiste, altrimenti i suoi identificativi vengono conservati così come sono e può fornire un suo file di corrispondenza. In ogni caso, le indica chiaramente quando l'annotazione automatica non è disponibile, anziché lasciarle credere a un risultato.

Prima di ogni analisi, Charlie rileva la scala dei suoi valori: si tratta di conteggi grezzi, di dati normalizzati, o di valori già in scala logaritmica? Questo rilevamento determina il trattamento applicato. Per esempio, per un'analisi delle componenti principali, i conteggi grezzi vengono prima normalizzati e poi trasformati in logaritmo, affinché la profondità di sequenziamento non mascheri il segnale biologico; i dati già logaritmici, invece, vengono lasciati intatti per evitare un doppio passaggio al log.

Tutto ciò che Charlie rileva e applica viene mostrato: la scala riconosciuta, la trasformazione utilizzata, gli eventuali geni esclusi. Può verificarlo e, se il rilevamento automatico sbaglia o resta incerto, correggere Lei stesso la scala.

A seconda di ciò che Charlie rileva, ecco cosa prepara e cosa può farne:

Per ogni analisi differenziale, il risultato è un fold-change in log2, viene applicata una correzione per test multipli (Benjamini-Hochberg predefinita), e degli avvisi segnalano i gruppi troppo piccoli.

La scheda Analisi copre le rappresentazioni più comuni: controllo qualità dei campioni, analisi delle componenti principali e UMAP per visualizzare la struttura dei dati, mappe di calore e correlazioni, distribuzioni, ed espressione differenziale (volcano e MA-plot). Per avviarne una, aggiunge una fase e indica, a seconda dell'analisi, i gruppi da confrontare o i parametri desiderati.

Può procedere in due modi. O costruisce le sue analisi da solo, scegliendo ogni fase e le sue impostazioni. Oppure si affida all'assistente Charlie, che può proporle un'analisi a partire dai suoi criteri e guidarla (veda più avanti). In entrambi i casi, è Lei a convalidare e avviare il calcolo.

Ogni analisi si presenta sotto forma di una fase aggiunta al suo rapporto, che riunisce in un unico posto tutto il contesto del risultato. Vi si trova il grafico stesso, accompagnato dalle informazioni che lo qualificano; dei parametri di regolazione che può modificare, e il cui effetto si ripercuote talvolta in tempo reale sulla figura; una legenda esplicativa, generata su richiesta, per interpretare il risultato; il dettaglio del calcolo, che richiama il metodo e le impostazioni applicate; eventuali avvisi di qualità; e un'anteprima dei dati che sono serviti a produrre il grafico. Vede così non solo il risultato, ma anche come è stato ottenuto.

Queste fasi si concatenano liberamente: le accumula per condurre la sua indagine, da una visione d'insieme verso i geni precisi che le interessano — che deposita quindi nel Carrello.

Il volcano è l'analisi dell'espressione differenziale: risponde alla domanda «quali geni si esprimono in modo diverso tra i miei due gruppi?». Ogni gene vi è collocato secondo due assi — l'ampiezza del cambiamento (il log2 fold-change, in orizzontale) e la solidità statistica del risultato (il p-value corretto, in verticale). Un gene è dichiarato «significativo» solo se supera contemporaneamente una soglia di ampiezza e una soglia di p-value: un forte cambiamento poco affidabile, o un risultato affidabile ma minuscolo, non è sufficiente. Due impostazioni, riunite nelle opzioni avanzate dell'analisi, governano questo verdetto.

Il test statistico si adatta alla natura dei suoi dati. Charlie adotta come impostazione predefinita il test t moderato (limma), il riferimento storico dell'analisi dell'espressione: anziché stimare la variabilità di ciascun gene isolatamente — cosa molto incerta quando i campioni sono pochi — consolida questa stima basandosi sull'insieme dei geni del set. Il guadagno è netto sui gruppi piccoli, la situazione più frequente. Il test di Welch, più classico, resta disponibile: su gruppi numerosi, i due metodi convergono verso lo stesso risultato, tanto che la scelta non ha allora quasi alcuna incidenza.

Su conteggi grezzi di RNA-seq, nessuno di questi due test è ideale: i metodi di riferimento si basano su un modello concepito per i conteggi, come DESeq2 o edgeR, ancora in sviluppo. Charlie applica allora un t-test a titolo di approssimazione e la avvisa che il risultato è esplorativo.

La correzione per test multipli, invece, è indispensabile. Un volcano testa migliaia di geni in una sola volta; senza correzione, una parte di essi risulterebbe «significativa» per puro effetto del caso. Charlie applica per impostazione predefinita la correzione di Benjamini-Hochberg, che tiene sotto controllo il tasso di false scoperte — il giusto compromesso per un'analisi a questa scala. Le correzioni di Bonferroni o di Holm, anch'esse disponibili, sono ben più severe: concepite per escludere il minimo falso positivo, diventano troppo conservative su migliaia di geni e rischiano di cancellare un segnale che è invece reale. Le riservi a casi particolari.

È infine la dimensione dei gruppi a determinare la potenza dell'analisi. Con un solo campione per gruppo, nessun test è possibile; con da due a quattro, la potenza resta molto limitata e i risultati valgono solo a titolo indicativo; è solo con gruppi più numerosi che le conclusioni diventano solide. Charlie segnala queste situazioni direttamente dove Lei configura l'analisi, poiché gruppi di piccole dimensioni associati a soglie rigorose portano spesso a «nessun gene significativo», anche quando un segnale debole esiste realmente.

Accanto alle sue analisi, un assistente conversazionale conosce il suo set di dati e l'insieme dei suoi risultati. Può chiedergli di spiegare una fase, una scelta o una figura in linguaggio chiaro, di commentare un risultato, o di proporle un'analisi corrispondente a ciò che cerca — e può liberamente modificarla, convalidarla e avviarla. Poiché si basa sui suoi dati reali e non su generalità, i suoi suggerimenti restano concreti e adatti al suo set. L'assistenza si arricchisce progressivamente: a oggi, la definizione dei gruppi di confronto, per esempio, resta nelle sue mani.

L'affidabilità di un'analisi dipende innanzitutto dai suoi dati e dalle sue scelte; Charlie non vi si sostituisce, ma segnala ciò che merita la sua attenzione, direttamente dove Lei configura l'analisi. La avvisa in particolare quando un gruppo conta troppo pochi campioni per un confronto solido, quando la scala dei dati è ambigua, o quando si tratta di conteggi grezzi, per i quali l'analisi differenziale rimane esplorativa (il metodo dedicato, come DESeq2, è in sviluppo).

La scelta del metodo statistico si adatta inoltre ai suoi dati — il test t moderato (limma) predefinito, il test di Welch se lo preferisce. E se qualche punto le sfugge, l'assistente può spiegarle una riserva o suggerirle un'impostazione più prudente. L'obiettivo non è decidere al posto suo, ma evitarle di trarre conclusioni su una base fragile senza saperlo.

Nel corso delle sue analisi, individua geni interessanti — i più fortemente differenziali, per esempio. Li raccoglie nel Carrello, che diventa la sua lista di lavoro. La scheda Arricchimento sfrutta poi questa lista per rispondere a una domanda di fondo: questi geni condividono una funzione, una via o un processo biologico? Charlie interroga le grandi basi di conoscenza — Gene Ontology, KEGG, Reactome, tra le altre — e mette in evidenza i termini significativamente sovra-rappresentati, al fine di passare da una semplice lista di geni a un'interpretazione biologica.

Charlie è progettato affinché possa giudicare da sé, anziché accordare una fiducia cieca. Tre principi lo guidano.

Il primo è la trasparenza: ogni decisione presa sui suoi dati — la scala rilevata, la trasformazione applicata, i geni esclusi, gli avvisi di qualità — è mostrata e modificabile. Nulla avviene in silenzio.

Il secondo è la spiegazione: l'assistente integrato può spiegarle in linguaggio chiaro una fase, una scelta o un risultato, e richiamare la sua attenzione sulle insidie di interpretazione.

Il terzo è la validazione su dati reali: i metodi di Charlie vengono confrontati con set di dati pubblicati, la cui biologia è nota, al fine di verificare che ritrovino effettivamente i segnali attesi (veda la domanda successiva).

Infine, una nota di onestà: Charlie riduce il rischio di errore silenzioso e segnala i suoi limiti, ma non sostituisce il suo giudizio scientifico. Per una pubblicazione, la revisione da parte di un esperto resta raccomandata.

Confrontiamo regolarmente Charlie con un insieme di set di dati pubblicati, la cui risposta biologica è nota in anticipo, e verifichiamo che ritrovi i segnali giusti — non solo che il calcolo venga eseguito. Due studi fungono oggi da riferimento: uno sull'essere umano (cellule delle vie respiratorie trattate con desametasone), l'altro sulla drosofila (inattivazione del gene Pasilla).

Su ciascuno, verifichiamo per esempio che i gruppi attesi si separino bene dopo la preparazione dei dati, che la profondità di sequenziamento non domini più l'analisi, e che i geni attesi emergano nel verso giusto — come CRISPLD2, indotto dal desametasone nello studio sull'essere umano, o il gene Pasilla stesso, represso nello studio in cui è stato precisamente inattivato.

Due precisazioni importanti. Questa validazione riguarda un campione di set di riferimento (due oggi, altri in arrivo), e non «tutti gli RNA-seq»: attesta l'affidabilità del metodo, non la correttezza di una particolare analisi condotta sui suoi dati. Inoltre, conferma che la biologia emerge correttamente, ma non punta a una corrispondenza numerica esatta con un metodo RNA-seq dedicato (DESeq2), ancora in sviluppo.