Häufige Fragen — Charlie Bioinformatik

Charlie arbeitet auf Basis einer Expressionsmatrix: einer Tabelle, in der die Gene in Zeilen und Ihre Proben in Spalten stehen. Zwei große Datenfamilien werden durchgängig unterstützt — DNA-Microarrays (microarray), deren Werte bereits in logarithmischer Skala vorliegen, und bereits normalisiertes RNA-seq (in CPM, TPM oder FPKM).

Sie können auch Rohzählungen (raw counts) aus RNA-seq laden. Charlie akzeptiert sie und bereitet sie korrekt für die Exploration auf (Hauptkomponentenanalyse, Heatmaps, Clusterbildung). Die differentielle Expressionsanalyse auf Rohzählungen bleibt hingegen explorativ: die statistische Referenzmethode für diesen Fall — ein negativ-binomiales Modell wie DESeq2 — befindet sich in Entwicklung. Charlie weist Sie darauf hin, bevor die Analyse gestartet wird.

Die folgende Tabelle liest sich Zeile für Zeile: der Dateityp, den Sie zur Hand haben, die Skala seiner Werte, die Verarbeitung, die Charlie automatisch darauf anwendet, und die Analysen, die Ihnen dann offenstehen.

All diese Daten messen dasselbe — die Genexpression, das heißt die RNA. Microarray und RNA-seq unterscheiden sich nur in der Art, sie zu messen. Der Hinweis „bereits normalisiert“ bezieht sich auf die Korrektur der Sequenziertiefe, die für das RNA-seq spezifisch ist: eine stärker sequenzierte Probe liefert überall höhere Werte, ohne dass ein Gen tatsächlich stärker exprimiert wäre, und CPM, TPM oder FPKM korrigieren diese rein technische Verzerrung. Da ein Microarray nicht sequenziert, betrifft dieser Begriff es nicht.

Ein letztes Wort zum Begriff „roh“, der zwei sehr unterschiedliche Realitäten umfasst. Rohzählungen sind bereits eine Tabelle aus Genen und Proben, nur noch nicht um die Sequenziertiefe korrigiert: Charlie akzeptiert sie. Sequenzierdateien (FASTQ) sind etwas ganz anderes — die Reads, die aus dem Sequenzierer kommen, weit vor jeder Tabelle. Charlie verarbeitet sie nicht: es geht stets von einer bereits vorliegenden Expressionsmatrix aus.

Sie können mit Ihren eigenen Dateien oder mit einem öffentlichen Datensatz arbeiten. Im ersten Fall importieren Sie eine Tabelle von Ihrem Rechner in den Formaten Excel, CSV oder TSV. Im zweiten Fall genügt es, eine GEO-Kennung anzugeben (in der Form GSE…): Charlie ruft den Datensatz dann direkt aus der öffentlichen Datenbank NCBI GEO ab, ohne dass Sie ihn selbst herunterladen müssen.

Jedes Projekt zeigt oben seine Herkunft und seine wichtigsten Merkmale an — den Titel der Studie, die Anzahl der Proben und Gene, die erkannte Skala und, bei einem GEO-Datensatz, seine Accession- und Plattform-Kennungen. Ein bereits importierter Datensatz kann zudem für ein neues Projekt wiederverwendet werden, ohne ihn erneut zu importieren.

Charlie gliedert die Arbeit in fünf Registerkarten, die der natürlichen Reihenfolge einer Analyse folgen.

Alles beginnt in der Registerkarte Daten, wo Sie Ihren Datensatz vorbereiten: Charlie erkennt dort Ihre Gene, prüft die Skala der Messungen, lässt Sie Ihre Vergleichsgruppen festlegen und eine Vorschau Ihrer Variablen durchsehen. Es folgt Analysen, wo Sie Ihre Darstellungen erstellen — Hauptkomponenten, Heatmaps, volcano — in Form von Schritten, die Sie im Verlauf Ihrer Untersuchung aneinanderreihen. Die Gene, die Ihre Aufmerksamkeit erregen, sammeln Sie im Korb. Ausgehend von diesem Korb hebt die Registerkarte Anreicherung die überrepräsentierten biologischen Funktionen und Pfade hervor. Schließlich wird die Bibliographie, die noch kommt, Ihre Gene mit der wissenschaftlichen Literatur verknüpfen.

Die Registerkarte Daten vereint alles, was Ihren Datensatz vor der Analyse vorbereitet und beschreibt, in drei Bereichen.

Der erste, Datenaufbereitung, ist ihr Kern. Charlie erkennt dort Ihre Gene (siehe nächste Frage) und erlaubt Ihnen dann, die Kennungen, die es nicht annotieren konnte, und die Spalten, die keine Gene sind, auszuschließen, fehlende Werte zu filtern und — wenn die Qualitätskontrolle es nahelegt — die Proben zu normalisieren, um sie vergleichbar zu machen. Jedes Mal schlägt Charlie eine Empfehlung vor, aber die Entscheidung liegt bei Ihnen.

Der zweite Bereich lässt Sie eigene Gruppen von Proben aus Ihren Variablen erstellen (nach Behandlung, nach Bedingung …), um die Vergleiche der Registerkarte Analysen vorzubereiten.

Der dritte, Datenvorschau, gibt einen sofortigen Gesamtüberblick: einen Auszug der Matrix, eine Zusammenfassung der erkannten kategorialen Variablen (Behandlung, Quelle usw.) und das Ranking der fünfzig variabelsten Gene — ein erster Blick auf das, was Ihre Proben unterscheidet, noch bevor eine Analyse gestartet wurde.

Eine Expressionsdatei enthält selten lesbare Gennamen: meist sind es Sondennummern (zum Beispiel ILMN_1802380) oder Datenbank-Kennungen (Entrez, Ensembl). Sie einzeln den Gennamen zuzuordnen ist eine langwierige und fehleranfällige Arbeit, zumal man Namen berücksichtigen muss, die sich im Laufe der Zeit geändert haben.

Charlie übernimmt das automatisch. Beim Import erkennt es den Typ Ihrer Kennungen, übersetzt sie in Gennamen und aktualisiert diejenigen, die veraltet sind, auf die gültige Nomenklatur. So erhalten Sie einen analysebereiten Datensatz, dessen Gene ihren aktuellen Namen tragen — ohne eine Zeile Code geschrieben oder eine Zuordnungstabelle konsultiert zu haben.

Vor allem wird Ihnen das Ergebnis unmissverständlich präsentiert. Das Banner „Annotation“ zeigt den Anteil der erkannten Gene an (zum Beispiel „8 763 von 9 980“), die Herkunft der Annotation und die Liste der Kennungen, die nicht zugeordnet werden konnten — aus den Analysen ausgeschlossen, statt fälschlich mitgezählt. Sie wissen also stets, was Charlie erkannt und was es beiseitegelassen hat.

Charlie annotiert automatisch die Gene von neun häufig untersuchten Arten: Mensch, Maus, Ratte, Fruchtfliege, Zebrafisch, dem Wurm C. elegans, der Bäckerhefe, der Modellpflanze Arabidopsis und dem Bakterium E. coli. Dazu kombiniert es mehrere Annotationsquellen, deren Verfügbarkeit von der Art abhängt. Die folgende Tabelle fasst die für jede eingesetzten Mittel zusammen.

Für diese neun Arten stützt sich die Übersetzung der Kennungen auf die maßgeblichen Bioconductor-Annotationsdatenbanken (die Spalte „Übersetzung“), was zuverlässige Gennamen gewährleistet. Die Aktualisierung veralteter Namen beruht auf der für jede Art zuständigen Nomenklaturautorität — HGNC für den Menschen, FlyBase für die Fruchtfliege und so weiter. Sie ist für die Hefe und Arabidopsis nicht verfügbar, deren Datenbanken keine Synonymtabelle bereitstellen; der Verlust ist gering, da bei diesen Arten wenige alte Namen im Umlauf sind. Die direkte Erkennung der Illumina-Chips schließlich betrifft nur Mensch, Maus und Ratte, da für die anderen Arten keine entsprechenden Chips existieren.

Wenn Sie mit einer Art arbeiten, die nicht in dieser Liste steht, bleibt die Analyse möglich: Charlie verwendet die von GEO bereitgestellte Annotation, sofern sie vorhanden ist, andernfalls werden Ihre Kennungen unverändert beibehalten und Sie können Ihre eigene Zuordnungsdatei bereitstellen. In jedem Fall weist es Sie klar darauf hin, wenn die automatische Annotation nicht verfügbar ist, statt Sie an ein Ergebnis glauben zu lassen.

Vor jeder Analyse erkennt Charlie die Skala Ihrer Werte: Handelt es sich um Rohzählungen, um normalisierte Daten oder um Werte, die bereits in logarithmischer Skala vorliegen? Diese Erkennung bestimmt die angewandte Verarbeitung. Zum Beispiel werden für eine Hauptkomponentenanalyse Rohzählungen zunächst normalisiert und dann logarithmiert, damit die Sequenziertiefe das biologische Signal nicht verdeckt; bereits logarithmische Daten werden hingegen unangetastet gelassen, um eine doppelte Log-Transformation zu vermeiden.

Alles, was Charlie erkennt und anwendet, wird angezeigt: die erkannte Skala, die verwendete Transformation, die gegebenenfalls ausgeschlossenen Gene. Sie können es überprüfen und, falls die automatische Erkennung sich irrt oder unsicher bleibt, die Skala selbst korrigieren.

Je nachdem, was Charlie erkennt, sehen Sie hier, was es vorbereitet und was Sie damit tun können:

Bei jeder differentiellen Expressionsanalyse ist das Ergebnis ein log2 fold-change, es wird eine Korrektur für multiples Testen angewandt (Benjamini-Hochberg standardmäßig), und Warnungen weisen auf zu kleine Gruppen hin.

Die Registerkarte Analysen deckt die gängigsten Darstellungen ab: Qualitätskontrolle der Proben, Hauptkomponentenanalyse und UMAP zur Visualisierung der Datenstruktur, Heatmaps und Korrelationen, Verteilungen und differentielle Expression (volcano und MA-plot). Um eine zu starten, fügen Sie einen Schritt hinzu und benennen, je nach Analyse, die zu vergleichenden Gruppen oder die gewünschten Parameter.

Sie können auf zwei Arten vorgehen. Entweder erstellen Sie Ihre Analysen selbst, indem Sie jeden Schritt und seine Einstellungen wählen. Oder Sie stützen sich auf den Charlie-Assistenten, der Ihnen anhand Ihrer Kriterien eine Analyse vorschlagen und Sie anleiten kann (siehe weiter unten). In beiden Fällen sind Sie es, der die Berechnung bestätigt und startet.

Jede Analyse erscheint als Schritt, der Ihrem Bericht hinzugefügt wird und den gesamten Kontext des Ergebnisses an einem Ort zusammenführt. Dort finden Sie den Graphen selbst, begleitet von den Informationen, die ihn näher bestimmen; Einstellungsparameter, die Sie ändern können und deren Wirkung sich mitunter live auf die Abbildung überträgt; eine erläuternde Legende, die auf Anfrage erzeugt wird, um das Ergebnis zu interpretieren; das Detail der Berechnung, das die Methode und die angewandten Einstellungen in Erinnerung ruft; etwaige Qualitätswarnungen; und eine Datenvorschau der Daten, die zur Erstellung des Graphen gedient haben. So sehen Sie nicht nur das Ergebnis, sondern auch, wie es zustande gekommen ist.

Diese Schritte reihen sich frei aneinander: Sie sammeln sie an, um Ihre Untersuchung voranzutreiben, von einem Gesamtüberblick hin zu den konkreten Genen, die Sie interessieren — die Sie dann in den Korb legen.

Der volcano ist die differentielle Expressionsanalyse: Er beantwortet die Frage „welche Gene sind zwischen meinen beiden Gruppen unterschiedlich exprimiert?“. Jedes Gen wird darin entlang zweier Achsen platziert — dem Ausmaß der Veränderung (dem log2 fold-change, waagerecht) und der statistischen Belastbarkeit des Ergebnisses (der korrigierten p-value, senkrecht). Ein Gen wird nur dann als „signifikant“ eingestuft, wenn es zugleich einen Schwellenwert des Ausmaßes und einen Schwellenwert der p-value überschreitet: eine starke, aber wenig zuverlässige Veränderung oder ein zuverlässiges, aber winziges Ergebnis genügt nicht. Zwei Einstellungen, zusammengefasst in den erweiterten Optionen der Analyse, bestimmen dieses Urteil.

Der statistische Test passt sich der Natur Ihrer Daten an. Charlie wählt standardmäßig den moderierten t-Test (limma), die historische Referenz der Expressionsanalyse: Statt die Variabilität jedes Gens einzeln zu schätzen — was sehr unsicher ist, wenn nur wenige Proben vorliegen — konsolidiert es diese Schätzung, indem es sich auf die Gesamtheit der Gene des Datensatzes stützt. Der Gewinn ist deutlich bei kleinen Gruppen, der häufigsten Situation. Der klassischere Welch-Test bleibt verfügbar: Bei großzügig besetzten Gruppen konvergieren beide Methoden zum selben Ergebnis, sodass die Wahl dann nahezu keine Auswirkung hat.

Bei Rohzählungen aus RNA-seq ist keiner dieser beiden Tests ideal: Die Referenzmethoden beruhen auf einem Modell, das für Zählungen konzipiert ist, wie DESeq2 oder edgeR, die sich noch in Entwicklung befinden. Charlie wendet dann einen t-Test als Näherung an und weist Sie darauf hin, dass das Ergebnis explorativ ist.

Die Korrektur für multiples Testen hingegen ist unerlässlich. Ein volcano testet Tausende von Genen auf einmal; ohne Korrektur würde ein Teil von ihnen allein durch Zufall als „signifikant“ erscheinen. Charlie wendet standardmäßig die Benjamini-Hochberg-Korrektur an, die die Falscherkennungsrate (FDR) kontrolliert — der richtige Kompromiss für eine Analyse in dieser Größenordnung. Die ebenfalls angebotenen Korrekturen nach Bonferroni oder Holm sind weit strenger: darauf ausgelegt, jeden noch so kleinen falsch positiven Treffer auszuschließen, werden sie bei Tausenden von Genen zu konservativ und drohen ein dennoch reales Signal zu tilgen. Behalten Sie sie besonderen Fällen vor.

Schließlich ist es die Gruppengröße, die die Aussagekraft der Analyse bestimmt. Mit nur einer einzigen Probe pro Gruppe ist kein Test möglich; mit zwei bis vier bleibt die Aussagekraft sehr begrenzt und die Ergebnisse haben nur orientierenden Wert; erst mit größer besetzten Gruppen werden die Schlussfolgerungen belastbar. Charlie weist auf diese Situationen direkt dort hin, wo Sie die Analyse konfigurieren, denn kleine Fallzahlen in Verbindung mit strengen Schwellenwerten führen oft zu „kein signifikantes Gen“, selbst wenn ein schwaches Signal tatsächlich vorhanden ist.

Neben Ihren Analysen kennt ein dialogfähiger Assistent Ihren Datensatz und die Gesamtheit Ihrer Ergebnisse. Sie können ihn bitten, einen Schritt, eine Entscheidung oder eine Abbildung in klarer Sprache zu erklären, ein Ergebnis zu kommentieren oder Ihnen eine Analyse vorzuschlagen, die dem entspricht, was Sie suchen — es steht Ihnen frei, sie anzupassen, zu bestätigen und zu starten. Da er sich auf Ihre realen Daten und nicht auf Allgemeinplätze stützt, bleiben seine Vorschläge konkret und auf Ihren Datensatz zugeschnitten. Die Unterstützung wächst schrittweise: bis heute liegt zum Beispiel die Festlegung der Vergleichsgruppen weiterhin in Ihrer Hand.

Die Zuverlässigkeit einer Analyse hängt zunächst von Ihren Daten und Ihren Entscheidungen ab; Charlie ersetzt sie nicht, aber es weist auf das hin, was Ihre Aufmerksamkeit verdient, direkt dort, wo Sie die Analyse konfigurieren. Es warnt Sie insbesondere, wenn eine Gruppe zu wenige Proben für einen belastbaren Vergleich zählt, wenn die Skala der Daten mehrdeutig ist oder wenn es sich um Rohzählungen handelt, für die die differentielle Expressionsanalyse explorativ bleibt (die dedizierte Methode, wie DESeq2, befindet sich in Entwicklung).

Die Wahl der statistischen Methode passt sich zudem Ihren Daten an — der moderierte t-Test (limma) standardmäßig, der Welch-Test, wenn Sie ihn bevorzugen. Und falls Ihnen ein Punkt entgeht, kann Ihnen der Assistent einen Vorbehalt erklären oder eine vorsichtigere Einstellung vorschlagen. Das Ziel ist nicht, an Ihrer Stelle zu entscheiden, sondern zu verhindern, dass Sie unwissentlich auf einer brüchigen Grundlage schließen.

Im Verlauf Ihrer Analysen entdecken Sie interessante Gene — zum Beispiel die am stärksten differentiellen. Sie sammeln sie im Korb, der zu Ihrer Arbeitsliste wird. Die Registerkarte Anreicherung nutzt diese Liste anschließend, um einer grundlegenden Frage nachzugehen: Teilen diese Gene eine Funktion, einen Pfad oder einen biologischen Prozess? Charlie fragt die großen Wissensdatenbanken ab — Gene Ontology, KEGG, Reactome und andere — und hebt die signifikant überrepräsentierten Begriffe hervor, um von einer bloßen Genliste zu einer biologischen Interpretation zu gelangen.

Charlie ist so konzipiert, dass Sie selbst urteilen können, statt blind zu vertrauen. Drei Prinzipien leiten es.

Das erste ist die Transparenz: jede Entscheidung, die zu Ihren Daten getroffen wird — die erkannte Skala, die angewandte Transformation, die ausgeschlossenen Gene, die Qualitätswarnungen — wird angezeigt und ist änderbar. Nichts geschieht im Verborgenen.

Das zweite ist die Erklärung: der integrierte Assistent kann Ihnen einen Schritt, eine Entscheidung oder ein Ergebnis in klarer Sprache erklären und Ihre Aufmerksamkeit auf Interpretationsfallen lenken.

Das dritte ist die Validierung an realen Daten: die Methoden von Charlie werden mit publizierten Datensätzen konfrontiert, deren Biologie bekannt ist, um zu überprüfen, dass sie die erwarteten Signale tatsächlich wiederfinden (siehe nächste Frage).

Ein Punkt der Ehrlichkeit zum Schluss: Charlie verringert das Risiko eines stillen Fehlers und weist auf seine Grenzen hin, ersetzt aber nicht Ihr wissenschaftliches Urteil. Für eine Publikation bleibt die Durchsicht durch einen Experten empfohlen.

Wir konfrontieren Charlie regelmäßig mit einer Reihe publizierter Datensätze, deren biologische Antwort im Voraus bekannt ist, und wir überprüfen, dass es die richtigen Signale wiederfindet — nicht nur, dass die Berechnung durchläuft. Zwei Studien dienen heute als Referenz: die eine beim Menschen (Zellen der Atemwege, behandelt mit Dexamethason), die andere bei der Fruchtfliege (Ausschaltung des Gens Pasilla).

Bei jeder überprüfen wir zum Beispiel, dass sich die erwarteten Gruppen nach der Datenaufbereitung gut trennen, dass die Sequenziertiefe die Analyse nicht mehr dominiert und dass die erwarteten Gene in die richtige Richtung hervortreten — wie CRISPLD2, das in der humanen Studie durch Dexamethason induziert wird, oder das Gen Pasilla selbst, das in der Studie, in der es gerade ausgeschaltet wurde, reprimiert ist.

Zwei wichtige Präzisierungen. Diese Validierung betrifft eine Stichprobe von Referenzdatensätzen (heute zwei, weitere folgen) und nicht „alle RNA-seq“: sie belegt die Zuverlässigkeit der Methode, nicht die Richtigkeit einer bestimmten Analyse, die an Ihren eigenen Daten durchgeführt wird. Im Übrigen bestätigt sie, dass die Biologie korrekt hervortritt, zielt aber nicht auf eine zahlengenaue Übereinstimmung mit einer dedizierten RNA-seq-Methode (DESeq2) ab, die sich noch in Entwicklung befindet.